Nous présentons ici un protocole pour injecter autologues muscle-dérivées des cellules souches dans la proximité du nerf laryngé récurrent à l’aide d’un stimulateur électrique des nerfs. Cette nouvelle technique peut devenir utile pour le traitement de la neuropathie laryngée récidivante équine.
La neuropathie laryngée récurrente (RLN) communément affecte les chevaux et se caractérise par des anomalies respiratoire sons exercice l’intolérance et. Le nerf laryngé récurrent montre des lésions de démyélinisation. Le bénéfice de l’application des cellules souches aux nerfs démyélinisés a été démontré dans divers modèles animaux. L’étude visait à tester la faisabilité et la sécurité d’une injection peri-neuronale du autologue muscle-dérivées cellules souches mésenchymateuses pour le nerf laryngé récurrent gauche chez le cheval en bonne santé à l’aide d’un stimulateur électrique des nerfs.
Cellule de muscle-dérivées des tiges sont obtenus à partir de cinq chevaux de race Standardbred en santé par l’échantillonnage de 20 mg de tissu musculaire avec une aiguille de biopsie semi-automatique 14 G de muscle triceps. Les mouvements du larynx sont surveillés via haut-voies aériennes vidéo endoscopie. Le nerf laryngé récurrent gauche est abordé avec une aiguille isolée tronculaires. La stimulation nerveuse est appliquée, à partir de 2 mA et l’enlèvement avec succès de la gauche cartilage est surveillé. L’intensité de la stimulation est réduite progressivement. Quand on observe une perte de la réponse motrice à 0,5 mA, 107 autologue muscle-dérivées souches sont injectées des cellules. Deux examinateurs, qui sont aveuglés au point de temps, marquer la fonction laryngée des chevaux avant le traitement et au jour 1, jour 7 et 28 jours après l’injection des cellules. Dans un sixième cheval, 1 mL de lidocaïne 2 % est injecté pour confirmer le bon positionnement de l’aiguille. Cela conduit à une paralysie temporaire du cartilage cartilage gauche.
Cette étude prouve que le nerf laryngé récurrent peut être abordé avec l’aide d’un stimulateur électrique des nerfs et que la stimulation électrique du nerf est bien toléré par les chevaux. Aucune modification de la fonction laryngée a été observée dans aucun des chevaux après l’injection des cellules souches. Supplémentaires doivent être menées pour décrire les effets d’une injection peri-neuronale du autologue muscle-dérivées cellules souches mésenchymateuses aux chevaux souffrant de RLN.
NKE est une pathologie fréquente des voies respiratoires supérieures chez les chevaux caractérisés par différents degrés de paralysie de cartilage. Le côté gauche du larynx est plus souvent affecté. La prévalence de la maladie peut atteindre jusqu’à 35 % dans certaines populations de chevaux. Bien que plusieurs hypothèses tenté d’expliquer l’étiologie et la pathogenèse de cette maladie, la cause exacte de RLN demeure incertaine. La pathologie est décrite comme une axonopathie distale du nerf laryngé récurrent avec des lésions de démyélinisation mais aussi une certaine remyélinisation. Cette axonopathie mène à la dénervation des muscles laryngés intrinsèques et atrophie concomitante1,2. Cette pathologie est souvent lentement progressive et peut conduire à une perte totale de l’enlèvement de cartilage du côté affecté3.
Des chevaux touchés émettent des bruits respiratoires anormaux au cours de l’exercice et montrent parfois, intolérance à l’exercice dans les cas plus graves. Le diagnostic est fait par l’examen endoscopique sur un cheval debout non sédatifs où on observe une perte partielle ou totale du larynx enlèvement1,2,4. Actuellement, le traitement le plus courant est laryngoplasty (également connu sous le nom « tie-back »), qui est parfois associée à une dérivation ventriculo-cordectomy. Bien que le taux de réussite global de ces chirurgies est considérée comme bon à excellente5, complications postopératoires sont très fréquents. La complication la plus fréquente est une perte progressive de l’enlèvement. Barnett et al. 6 a enregistré une perte d’au moins un grade d’enlèvement dans les six premières semaines suivant la chirurgie chez au moins 76 % des chevaux. Autres complications, telles que la rupture de la prothèse, la toux et la contamination des voies aériennes, sont également signalés5.
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été une partie de la médecine équine dans la recherche et la pratique depuis plus de dix ans, bien que les études sur leur efficacité sont encore rares. Les deux plus couramment exploitées sources de cellules souches mésenchymateuses adultes chez les chevaux sont la moelle osseuse et le tissu adipeux7. Les deux techniques d’échantillonnage sont relativement invasifs et ne conduisent pas toujours à un nombre suffisant de cellules. Récemment, Ceusters et al. 7 décrit la culture de cellules souches provenant de tissus de muscle strié, qui sont obtenu par une technique moins invasive de microbiopsy.
MSCs sont capables d’auto-renouvellement, autoproduction, multipotentialité et différenciation7,8. Leur capacité à se différencier en toutes les lignées de mésoderme de graisse, OS, muscle et cartilage est maintenant bien établi9. Toutefois, dans des conditions environnementales spécifiques, elles peuvent se différencier en lignées non-mésenchymateuse comme les neurones, les astrocytes et les cellules myélinisantes du système nerveux périphérique et la moelle épinière9,10. MSCs ont déjà été utilisés dans plusieurs neuropathie modèles10,11. Leur capacité à migrer vers des zones du tissu nerveux dégénéré et de régénérer les cellules nerveuses a été démontrée après une administration systémique et locale11. En outre, les cellules de Schwann-comme dérivés de MSCs peuvent recruter des macrophages pour supprimer les débris cellulaires et sécrètent des facteurs neurotrophiques favorisant la croissance axonale et remyélinisation9.
Le but de cette étude est de décrire la technique d’une injection de guidée par stimulateur de nerf du muscle-dérivées des cellules souches autologues près du nerf laryngé récurrent gauche chez le cheval en bonne santé. En règle générale, un stimulateur de nerf relié à une aiguille d’injection est utilisé pour l’electro-localisation des nerfs périphériques afin d’appliquer des anesthésiques locaux à cette zone12. Une impulsion de courant faible est fournie à proximité du nerf pour induire une réponse motrice. La capacité de produire cette réponse motrice dépend de plusieurs paramètres, tels que la zone conductrice de l’aiguille, une impédance quelconque du tissu, le courant appliqué, la durée de l’impulsion et la distance entre l’aiguille et le nerf. Aiguilles de stimulateur de nerf sont conçus pour avoir une zone conductrice très restrictive à la pointe de l’aiguille, alors que le reste de l’aiguille est isolé. Cette conception permet de localiser avec précision le nerf. Neurostimulateurs moderne s’adaptent à différentes impédances de tissus et de livrer l’ampérage constant sur la machine. Par ailleurs, la plupart des machines utilisent une durée d’impulsion de 0,1 s, afin que les paramètres déterminants sont le courant appliqué et la distance à l’aiguille. La relation entre la distance de l’aiguille-à-nerf et le courant nécessaire pour produire une réponse motrice est décrite par la Loi de Coulomb : E = kQ/r ; où E est la charge de stimulation nécessaire, k est la constante de Coulomb, Q est la charge minimale requise stimulation et r est la distance entre les deux électrodes. Dans l’électro-localisation des nerfs, la distance entre les deux électrodes est réputée être la distance de l’aiguille-à-nerf12. Charge électrique se dissipe après la règle du carré inverse de la distance de l’aiguille-à-nerf13. Pratique clinique a montré que le moteur nerve stimulation à 0,5 mA est fortement corrélée au bloc nerf réussi et qu’une perte de signal moteur en cas de courant inférieures empêche l’utilisateur d’administrer des injections intraneuronal accidentelles. Le but de cette étude est de tester la faisabilité et l’innocuité de cette technique dans un nombre limité de chevaux. Si la faisabilité et l’innocuité de cette technique sont confirmées, il peut être facilement transférée aux chevaux touchés. En outre, équins RLN peut servir de modèle pour une neuropathie dégénérative.
Ce protocole décrit l’application réussie de muscle-dérivées des cellules souches autologues pour les nerfs laryngés récurrents chez les chevaux à l’aide d’une approche guidée par stimulateur de nerf. La récolte de l’échantillon microbiopsy de muscle, ainsi que l’isolement, la culture et caractérisation des cellules souches, ont été décrits en détail avant, tandis que l’injection de ces cellules à proximité d’un nerf périphérique est originale. L’electro-localisation du nerf avec un stimulateur électrique des nerfs a servi pour la présente étude et a été utilisée pour injecter des cellules souches mésenchymateuses à proximité directe du nerf laryngé récurrent. La réponse motrice a été surveillée par vidéo-endoscopie dans le nasopharynx. Si, au cours du processus de positionnement de l’aiguille, autres nerfs sont stimulées, le mouvement correspondant était visible sur l’écran d’endoscopie. Une stimulation efficace du nerf laryngé récurrent a été caractérisée par l’enlèvement typique du cartilage cartilage. Chez un cheval, anesthésique local est injecté pour induire une paralysie transitoire du muscle du cartilage. Bien que l’implantation réussie des cellules à proximité du nerf n’a pas été testée spécifiquement dans la présente étude, l’electro-localisation du nerf et l’injection avec un faible courant a prouvé que les cellules souches ont été appliqués près du nerf. La proximité de l’injection de co-set du nerf est encore démontrée par un bloc moteur réussi induit par l’injection d’un anesthésique local.
Dans les 5 chevaux restants, le temps de la première stimulation jusqu’à ce que l’injection des cellules souches réussie variait de 3 à 12 min. chevaux était légèrement sous sédation au cours de la procédure, qui a augmenté leur conformité avec la stimulation électrique. Aucun des chevaux ont montré des effets indésirables à tout moment, ce qui indique que la durée de la stimulation peut être prolongé si nécessaire pour obtenir la bonne aiguille positionnement. Une courbe d’apprentissage abrupte devrait être observée si l’opérateur utilise cette technique régulièrement et dans un plus grand nombre de chevaux avec divers anatomie.
Les chevaux couramment souffrent de RLN, qui se caractérise par des degrés de paralysie du cartilage gauche cartilage conduisant à des bruits respiratoires anormaux et exercent l’intolérance. Une histologie de nerfs touchés révèle des lésions typiques d’une neuropathie périphérique16. La neuropathie périphérique est un terme utilisé pour décrire les différents types de lésions nerveuses périphériques conduisant à une altération des sensations, mouvements ou fonctions de l’organe. Les causes sont très variables et peuvent comprendre le diabète, carences nutritionnelles, un traitement par des médicaments spécifiques, un traumatisme, une ischémie ou une infection, ou ils peuvent être idiopathiques. Indépendamment de la cause, les neuropathies périphériques partagent des signes histopathologiques communs, comme la dégénérescence wallérienne, axonopathie distale ou démyélinisation segmentaire. Il a été démontré que l’administration des cellules souches mésenchymateuses de lésions nerveuses périphériques peut être bénéfique pour leur régénération ; Cependant, les mécanismes sous-jacents ne sont pas bien compris. Traditionnellement, nous pensons que les cellules souches mésenchymateuses sera seulement se différencient en progéniteurs des tissus adipeux, muscle, cartilage et le tissu osseux, mais sous certaines conditions, elles ont été montrées à se différencier en myocytes17, astrocytes18 et les cellules myélinisantes du périphérique19 et du système nerveux central,19. Au cours d’une culture in vitro , une exposition à des neuropeptides favorisera la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules expriment des marqueurs neuronaux21,22. Plusieurs des études in vivo ont démontré l’effet bénéfique des cellules souches mésenchymateuses sur la régénération des nerfs et une récupération fonctionnelle dans des modèles de rat de nerf sciatique blessure10,23. Ceci est probablement causé par des conditions environnementales favorables qui contribuent à la différenciation des cellules souches en cellules de tissu-spécifique24. Les études futures devraient étudier aussi cette technique pour l’administration de cellules pré différenciées en chevaux touchés RLN.
Au meilleur de notre connaissance, c’est le premier rapport qui décrit l’utilisation d’un stimulateur de nerf pour localiser un nerf périphérique afin d’injecter un traitement spécifique en elle. Autres pathologies des nerfs périphériques chez diverses espèces, comme la douleur neuropathique, peuvent être traitées par l’administration des cellules souches à proximité du nerf25,26. Les études futures devraient vérifier l’effet de cette technique chez les patients de cliniques et enquêter sur le risque de migration et le potentiel de différenciation des cellules injectées.
The authors have nothing to disclose.
L’étude a été financée par le Centre de recherche équine de Mont-le-Soie.
Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG – 14090C | |
Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
DMEM – F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
Trypsin | Life technologies | 12604 | |
HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
NaCl | Sigma | S8776 | |
T-25cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |