在这里, 我们提出了一个协议, 注射自体肌源干细胞在接近喉返神经的帮助下, 神经刺激器。这项新的技术可能会有助于治疗马复发性喉神经病变。
喉返神经病 (RLN) 通常影响马匹, 其特点是异常的呼吸声音和运动不耐受。喉返神经表现为脱髓鞘病变。在各种动物模型中, 应用干细胞脱髓鞘神经的好处已经得到了证明。本研究的目的是通过使用电神经刺激器, 测试在健康马匹的左喉返神经的周围神经元注射自体肌间充质干细胞的可行性和安全性。
肌肉衍生的茎细胞是从五健康的 Standardbred 马, 通过取样20毫克的肌肉组织与半自动 14 G 活检针从三头肌。通过上呼吸道视频内窥镜监测喉部的运动。左侧喉返神经与绝缘神经阻滞针接触。神经刺激被应用, 从 2 mA 开始, 并且成功的绑架左杓被监视。刺激强度逐渐降低。当 0.5 mA 观察到马达反应丢失时, 注射 107自体肌肉源干细胞。两名考官, 谁是失明的时间点, 得分的喉功能的马匹治疗之前和1天, 7 天, 28 天后, 注射细胞。在第六匹马, 注射1毫升2% 利多卡因进一步确认正确的定位针。这导致左杓软骨暂时麻痹。
这项研究证明, 喉返神经可以在电神经刺激器的帮助下接近, 而这种神经的电刺激很好地被马匹所耐受。在任何马匹注射干细胞后, 均未观察到喉功能的改变。应进行进一步的研究, 以描述周围神经元注射自体肌间充质干细胞对 RLN 的马匹的影响。
RLN 是马上呼吸道的常见病理表现为不同程度的杓麻痹。喉的左侧是最常见的影响。在某些马种群中, 这种疾病的患病率可达35%。虽然有几个假说试图解释这种疾病的病因和发病机制, 但 RLN 的确切原因仍然不确定。病理被描述为喉返神经的远端 axonopathy 与脱髓鞘病变, 但也有一定程度的 remyelination。这 axonopathy 导致固有喉部肌肉的神经支配和伴随萎缩1,2。这种病理学往往缓慢进步, 并可能导致完全丧失杓绑架的受影响的一侧3。
受影响的马匹在运动期间发出异常的呼吸声音, 有时在更严重的情况下表现出运动不耐受。明确诊断是由内镜检查的非镇静站立马, 其中部分或全部损失的喉部诱拐观察1,2,4。目前, 最常见的治疗方法是会厌 (也称为 “栓背”), 有时与脑室声带切除术。虽然这些手术的整体成功率被认为是好到优秀5, 手术后并发症是非常常见的。最常见的并发症是逐渐失去诱拐。巴奈特等。6报告说, 至少在76% 匹马的手术后的前六周内, 至少有一级诱拐发生。其他并发症, 如假肢失败, 咳嗽和呼吸道污染, 也报告5。
骨髓间充质干细胞 (MSCs) 在研究和实践中一直是马医学的一部分, 在过去的十年中, 尽管对其效率的证明性研究仍然缺乏。最常见的两种来源的成人骨髓间充质干细胞的马匹是骨髓和脂肪组织7。两种取样技术都是相对侵入性的, 并不总能导致足够数量的细胞。最近, Ceusters等。7描述了由一种微创 microbiopsy 技术获得的横纹肌组织产生的干细胞培养。
MSCs 具有自我更新、自生成、多向分化潜能和分化7、8的能力。他们的能力分化成所有胚层血统的脂肪, 骨骼, 肌肉和软骨现在已经建立9。然而, 在特定的环境条件下, 它们可以分化为非间质血统, 如神经元、星形胶质细胞、周围神经系统的 myelinating 和脊髓9、10。MSCs 已经被用于一些神经病模型10,11。他们的能力迁移到退化的神经组织地区和再生神经细胞已经证明了在系统和地方管理11。此外, 从 MSCs 中提取的许旺样细胞可以招募巨细胞来去除细胞碎片, 分泌神经营养因子促进轴突生长和 remyelination9。
本研究的目的是描述神经刺激器引导注射的肌肉衍生自体干细胞附近的左喉返神经的健康马。通常, 与注射针连接的神经刺激器用于周围神经的电定位, 以便将局部麻醉药应用到该区域12。微弱的直流脉冲供应在接近神经附近导致马达反应。产生这种马达反应的能力取决于几个参数, 如针的导电面积, 组织的任何阻抗, 电流的应用, 脉搏持续时间, 以及从针到神经的距离。神经刺激针被设计成有一个非常限制性的传导区域在针的尖端, 而其余的针是绝缘的。这种设计有助于精确定位神经。现代神经刺激适应不同的组织阻抗和交付恒定的安培量设置在机器上。此外, 大多数机器使用的脉冲持续时间为0.1 秒, 因此决定参数是电流的应用和距离的针。用库仑定律描述了针-神经距离与产生电机响应所需电流之间的关系: E = kQ/r;当 E 是所需的刺激电荷时, k 是库仑常数, Q 是所需的最小激励电荷, r 是两个电极之间的距离。在神经的电定位中, 两个电极之间的距离被认为是针到神经距离的12。电荷在针到神经距离的逆平方的规则下消散13。临床实践表明, 0.5 mA 的运动神经刺激与成功的神经阻滞密切相关, 而在较低电流下的电机信号丢失将阻止用户进行意外 intraneuronal 注射。本研究的目的是在数量有限的马匹中测试这种技术的可行性和安全性。如果这项技术的可行性和安全性得到确认, 可以很容易地转移到受影响的马匹。此外, 马 RLN 可作为周围变性神经病变的模型。
本协议描述了肌肉衍生自体干细胞在马喉返神经中的成功应用, 采用神经刺激引导的方法。肌肉 microbiopsy 标本的收获, 以及干细胞的分离、培养和表征, 已经被详细描述, 而这些细胞的注射接近周围神经是原始的。神经与电神经刺激器的电定位为目前的研究提供了服务, 并被用来注射与喉返神经直接接近的间充质干细胞。通过鼻咽部视频内窥镜对电机反应进行监测。如果在针的定位过程中, 其他神经受到刺激, 相应的运动在内窥镜屏幕上可见。一个成功的刺激复发喉神经的特点是典型的绑架杓软骨。在一匹马, 局部麻醉注射, 以诱发暂时性瘫痪的杓肌肉。虽然在本研究中, 细胞的成功植入在神经附近没有得到具体的测试, 但是神经的电定位和低电流的注射都证明了干细胞在神经附近的应用。injectate 到神经的接近度进一步证明由一个成功的马达块由地方麻醉剂的注射诱导。
在剩下的五匹马中, 从第一次刺激到成功的干细胞注射的时间从3到12分钟不等. 马匹在手术过程中略有镇静, 这增加了他们对电刺激的依从性。没有一匹马在任何时候都表现出不良反应, 这表明刺激的持续时间可以在必要时延长, 以获得良好的针定位。如果操作者经常使用这项技术, 并且在更大数量的马匹上有不同的解剖, 那么就会发现一个陡峭的学习曲线。
马通常患有 RLN, 其特点是不同程度的左杓软骨麻痹导致异常的呼吸声音和运动不耐受。受影响神经组织学显示典型的周围神经病变16。周围神经病变是用来描述各种类型的周围神经病变导致的感觉, 运动, 或器官功能受损。原因是高度可变的, 可能包括糖尿病, 营养缺乏, 治疗与特定药物, 外伤性损伤, 缺血, 或感染, 或他们可以是特发。与病因无关, 外周神经病共有常见的病理学征象, 如沃勒变性、远端 axonopathy 或节段脱髓鞘。结果表明, 骨髓间充质干细胞对周围神经损伤的管理可能有利于其再生;然而, 根本的机制还没有得到很好的理解。传统上, 我们认为间充质干细胞只会分化为脂肪、肌肉、软骨和骨组织的祖细胞, 但在特定的条件下, 它们已被证明可以分化为心肌细胞17, 星形胶质细胞18和 myelinating 细胞的外围19和中枢神经系统19。在体外培养中, 接触神经肽有利于将间充质干细胞分化为表达神经元标记物21、22的细胞。几项活体研究表明, 骨髓间充质干细胞对大鼠坐骨神经损伤模型的神经再生和功能恢复有有益的影响,10、23。这可能是由于有利的环境条件, 导致干细胞分化为组织特异细胞24。今后的研究还应探讨这一技术, 以管理的预分化细胞在 RLN 受影响的马匹。
据我们所知, 这是第一份报告, 描述了使用神经刺激器定位周围神经, 以便向它注入特定的治疗。其他的周围神经病理在不同的种类, 如神经病理性疼痛, 可以治疗的干细胞的管理接近神经25,26。今后的研究应测试该技术在临床患者中的作用, 并探讨移植的风险和注射细胞分化的可能性。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由 Soie 马研究中心资助。
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