JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

עצב מונחה ממריץ הזרקה של תאי גזע עצמיים ליד הסוסים עזבו חוזרים ונשנים עצב בגרון

Published: September 26, 2018
doi:
10.3791/58023
, , , , , ,
1Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine,University of Liege, 2Mont-le-Soie Equine Research Centre

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק עצמיים שריר-derived בתאי גזע מהקרבה העצב בגרון חוזרים ונשנים עם העזרה של הקוצב העצבי חשמל… טכניקה חדשנית זו עשוי להיות שימושי עבור הטיפול של הסוסים חוזרים ונשנים נוירופתיה בגרון.

Abstract

נוירופתיה בגרון חוזרים ונשנים (RLN) בדרך כלל משפיע על סוסים, מאופיין על-ידי חריגה הנשימה סובלנות נשמע ופעילות גופנית. העצב בגרון חוזרים ונשנים מראה נגעים של demyelination. היתרון של החלת תאי גזע על העצבים demyelinated הוכח במודלים של בעלי חיים שונים. מטרת המחקר הייתה לבחון את ההיתכנות והבטיחות של זריקת פרי עצבית של עצמיים שריר-derived בתאי גזע mesenchymal על העצב השמאלי בגרון חוזרים ונשנים אצל סוסים בריאים באמצעות של הקוצב העצבי חשמל.

תא השריר הנגזרות נובעת מתקבלים מן חמישה סוסים Standardbred בריא באמצעות דגימת 20 מ ג של רקמת שריר עם מחט הביופסיה 14 G חצי אוטומטי מ לשריר הסובך. תנועות של הגרון הם תחת פיקוח באמצעות דרכי הנשימה העליונה וידאו אנדוסקופיה. העצב השמאלי בגרון חוזרים ונשנים הוא ניגש עם מחט בלוק עצב מבודד. גירוי עצבי מוחל, החל מ- 2 אמא ולאחר חטיפת מוצלחת arytenoid השמאלי מנוטר. עוצמת גירוי פוחתת בהדרגה. מתי לאובדן של התגובה המוטורית נצפית ב- 0.5 אמא, 107 עצמיים שריר-derived גזע תאים מוזרקים. שני הבוחנים, מסונוורים לנקודת הזמן, תוצאת הפונקציה בגרון של הסוסים לפני הטיפול, יום 1 יום 7, 28 יום לאחר ההזרקה של התאים. ב סוס השישי, מ 1 ל 2% לידוקאין מוזרק לאשר עוד יותר למקם נכון את המחט. זה מוביל לשיתוק זמני של הסחוס הקיתוני השמאלי.

מחקר זה מוכיח כי ניתן לצפות העצב בגרון חוזרים ונשנים עם העזרה של הקוצב העצבי חשמל, גירוי חשמלי של העצב זה טוב נסבל על ידי הסוסים. אין שינוי של הפונקציה בגרון נצפתה בכל אחד הסוסים לאחר ההזרקה של תאי גזע. יש לנהל מחקרים נוספים כדי לתאר את ההשפעות של זריקת פרי עצבית של עצמיים שריר-derived בתאי גזע mesenchymal סוסים הסובלים RLN.

Introduction

RLN היא מחלה נפוצה של דרכי הנשימה העליונות אצל סוסים המאופיינת בדרגות שונות של שיתוק arytenoid. הצד השמאלי של הגרון מושפע בדרך כלל. השכיחות של המחלה יכולים להגיע עד 35% באוכלוסיות מסוימות סוס. למרות מספר השערות ניסה להסביר את אטיולוגיה, פתוגנזה של המחלה, הגורם המדויק של RLN נשאר לא ברור. הפתולוגיה מתואר axonopathy דיסטלי של עצב בגרון חוזרים ונשנים עם נגעים של demyelination אבל גם מידה מסוימת של remyelination. Axonopathy הזה מוביל denervation של שרירים בגרון מהותי וניוון והמצוות1,2. ההפרעה הזאת הוא לרוב מתקדמת לאט, עלול להוביל לאובדן מוחלט של החטיפה arytenoid של הצד המושפע3.

סוסים המושפעת פולטים קולות נשימה חריג במהלך פעילות גופנית ולהראות, לפעמים, תרגיל סובלנות במקרים החמורים יותר. להשלים את האבחנה נעשית על ידי בבדיקה אנדוסקופית על סוס ללא תרופות הרגעה עומד היכן אובדן חלקי או מלא של חטיפה בגרון נצפית1,2,4. כיום, הטיפול השכיח ביותר הוא laryngoplasty (הידוע גם בשם “עניבה-גב”), אשר משויכת לפעמים ventriculo-cordectomy. למרות שיעור ההצלחה הכוללת של ניתוחים אלה הוא נחשב טוב מעולה5, סיבוכים מיותרים נפוצים מאוד. הסיבוך הנפוץ ביותר הוא לאובדן הדרגתי של חטיפה. . ברנט ואח 6 דיווח על הפסד של כיתה אחת לפחות של חטיפת בתוך בששת השבועות הראשונים שאחרי הניתוח ב- 76% לפחות של סוסים. סיבוכים אחרים, כגון כשל תותבת, שיעול, זיהום דרכי הנשימה, הם גם דווח על5.

גזע mesenchymal (MSCs) היו חלק הרכיבה ברפואה פרקטיקה ומחקר במשך יותר מעשור, למרות הוכיחו מחקרים על היעילות שלהם עדיין נדירים. שני מקורות מנוצלת הנפוץ ביותר של גזע mesenchymal למבוגרים אצל סוסים הם מח עצם, רקמת שומן7. בשתי הטכניקות דגימה פולשני יחסית, לא תמיד להוביל מספר מספיק של תאים. לאחרונה, Ceusters. et al. 7 תיאר את התרבות של תאי גזע שמקורם רקמת השריר, אשר מתקבל על ידי הטכניקה microbiopsy פחות פולשני.

MSCs מסוגלים התחדשות עצמית, דור עצמית, multipotency ובידול7,8. היכולת להבדיל לתוך כל שושלות והמזודרם של שומן, עצם, שריר, סחוס כבר וותיקה9 עם זאת, בתנאים סביבתיים מסוימים, הם יכולים להתמיין שושלות הלא-mesenchymal כגון נוירונים, האסטרוציטים myelinating תאים של מערכת העצבים ההיקפית, השדרה ה-9,10. MSCs כבר בשימוש מספר נוירופתיה מודלים10,11. יכולתם לנדוד לאזורים רקמות עצבים מנוונת ו לחדש תאים עצביים הוכח לאחר ניהול מערכתי מקומיים11. יתר על כן, תאי שוואן דמוי נגזר MSCs יכול לגייס מקרופאגים הסרת לכלוך הסלולר, מפרישים neurotrophic גורמים מקדמים צמיחה עצב ו- remyelination9.

מטרת מחקר זה היא לתאר את הטכניקה של זריקת מונחה ממריץ עצב של שרירים-derived תאי גזע עצמיים ליד העצב השמאלי בגרון חוזרים ונשנים אצל סוסים בריאים. בדרך כלל, הקוצב העצבי מחובר של הזרקת מחטני משמש עבור האלקטרו-הלוקליזציה של העצבים ההיקפיים כדי לפנות את האזור12הרדמה מקומית. דחף זרם חלש מסופק בסמיכות העצב לגרום לתגובה מוטורית. היכולת לייצר תגובה מוטורית זו תלויה במספר פרמטרים, כגון אזור ואטימה של המחט, כל עכבה של הרקמה, הזרם חלה, משך דופק את המרחק מן המחט על העצב. מחטים ממריץ עצב נועדו יש אזור מוליך מגבילה ביותר בקצה המחט, בעוד שאר המחט הוא מבודד. עיצוב זה מסייעת למקם במדויק את העצב. תכשירים עצב מודרניים להסתגל impedances רקמות שונות ולהעביר האמפר מתמיד להגדיר במחשב. יתר על כן, רוב מכשירי להשתמש עם משך פעימה של 0.1 s, כך מכריעה הפרמטרים הם הזרם מוחל, המרחק המחט. הקשר בין המרחק מחט-כדי-עצב את הצורך נוכחית לייצר תגובה מוטורית מתואר על ידי חוק קולון: E = kQ/r; כאשר E הוא האישום נדרש גירוי, k הוא קבוע קולון, Q האשמה גירוי מינימלי הנדרש ו r הוא המרחק בין שתי אלקטרודות. האלקטרו-הלוקליזציה של העצבים, המרחק בין שתי אלקטרודות נחשב להיות המחט-כדי-עצב מרחק12. מטען חשמלי כלתה בעקבות החוק של הכיכר ההופכי של מחט-כדי-עצב מרחק13. הקליני מראה כי המנוע עצבי גירוי-0.5 אמא הוא מאוד מתואם כדי לחסום את העצב מוצלחת, כי אובדן איתותים מנוע-זרמים נמוכים ימנע למשתמש מתן זריקות intraneuronal בשוגג. מטרת מחקר זה היא לבחון את ההיתכנות והבטיחות של טכניקה זו במספר מוגבל של סוסים. אם ההיתכנות והבטיחות של טכניקה זו מאושרות, זה ניתן בקלות להעביר סוסים המושפעת. יתר על כן, הסוסים RLN יכול לשמש מודל עבור נוירופתיה ניוונית.

Protocol

הנציבות לשימוש האתית של חיות של אוניברסיטת והשליט אושר פרוטוקול המחקר. 1. שריר Microbiopsy לזהות אתר דוגמת בדיקה ויזואלית, מישוש, בראש ארוך של שריר הסובך, כ קו האמצע בין הנקודה של המרפק לנקודה של הכתף. קליפ אזור של 2 ס מ2 עם קוצץ חשמלי. החל בניתוחים כירורגיים המורכב polyiodide סבון נוזלי, אלכוהול דוחס עבור 1 דקות מעל האזור החתוכים. מזריקים subcutaneously 1 מ”ל של 2% לידוקאין פתרון עם מחט 25 גרם במרכז של אזור החתוכים ואת מחוטא. לשפשף את הידיים עם סבון אנטי-בקטריאלי ידיים. . תלבש כפפות סטריליות להשתמש תלוי סטרילי חד פעמיות משטח סטרילי למקם את מחט הביופסיה, את הנקז. חמשו את מחט הביופסיה 14 G חצי אוטומטי על ידי משיכת מנגנון קפיץ כפי שמוצג דמויות 1b וג 1. שחרר את מחט הביופסיה טדי במנגנון שלה. מקם את מחט הביופסיה חמושים על משטח סטרילי. עירכו היכרות עם הנקז, אשר מורכב של בצינורית האטם כפי שמוצג באיור 1. איור 1 : ערכת מחט הביופסיה. ערכת מחט הביופסיה מורכב () את הצינורית, האטם שלו, הביופסיה מחט (מלמעלה למטה). הלוחות האחרים להציג את מחט הביופסיה שלה (b) נייטרלי וחמושים (c) עמדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להכין את הנקז על ידי הרכבת את הצינורית, את האטם ולשמור אותם במצב נעול. מציגים את הנקז בניצב על העור דרך אזור desensitized לשעבר. לקדם את הנקז למיקום איפה קצה הנקז כ 1.5 ס מ לעומק השריר. תוציאי את הנקז, לנתק את הצינורית של האטם שלו, ולמקם את האטם על משטח סטרילי. מציגים את מחט הביופסיה חמושים דרך הצינורית. להחדיר את המחט, את הצינורית דרך החתך בעור לתוך השריר. תוחבים את המחט למיקום איפה קצה המחט באמצע הראש הארוך של שריר הסובך. לשחרר את מחט הביופסיה ולאחר מכן משוך החוצה את מחט הביופסיה יחד עם הצינורית. משוך את מחט הביופסיה הצינורית. להשאיר את הצינורית על משטח סטרילי. פתח את מחט הביופסיה על ידי משיכת המעיין עם יד אחת מחזיקה אותו עם האחר.הערה: הדגימה הופך לגלוי בקצה מחט הביופסיה. עם העזרה של אדם השני, פתח הצינור מדגם המכיל המדיום הדגימה. השתמש מחט תת-עורית 19 ז כדי להסיר את החתיכה שרירים זעירים מחט הביופסיה. מקם את דגימת שריר המדיום הדגימה. סגור את הצינור עם הכיפה בורג, בעדינות להטות את זה 2 x כדי להבטיח כי המדגם צף במדיום. חמשו את מחט הביופסיה. . קח את הצינורית משטח סטרילי ולהרכיב את מחט הביופסיה חמושים ואת הצינורית. להחדיר את המחט חמושים, את הצינורית דרך החתך בעור כאמור תיאר. חזור על הפעולות מדגם 2 – 3 x עד נדגמים כ 20 מ ג של רקמת שריר. סגור את הצינור הדגימה. בעדינות לפנות את הצינור 2 x כדי לערבב את החלקים שריר עם המדיום הדגימה. לשלוח הדגימות למעבדה בטמפרטורה קבועה בין 4 ל 8 מעלות צלזיוס.הערה: המעבדה ואז יעבד את המדגם. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. הפרוצדורה היא נסבלת היטב, כאב בצד דגימה לא נצפית. במקרה הלא סביר של כאב שרירים נצפו באתר דגימה, לנהל את הטיפול המתאים להרגעה. 2. טיפול של תאים הערה: תאי הגזע השתמשו במחקר זה הוכנו על פי השיטה המתוארת על-ידי. Ceusters et al. 7. המאמר שלהם גם מתאר את האפיון של התאים. התחל על-ידי הכנת המדיום תרבות מסוימת, DF20, על-ידי הוספת 20% של חום-לא פעיל העובר שור סרום, 5 מ של פניצילין (1000 IU/mL)-סטרפטומיצין (10,000 µg/mL), ו- 2.5 מ של המפוטריצין (250 µg/mL) לבקבוק של 500 מ של זמינים מסחרית תרבות בינוני עם גלוטמין ו פנול אדום. שופכים µL 150 של המדיום תרבות DF20 לתוך כל אחד 16 הבארות הפנימי של צלחת 24-multi-טוב. שופכים 1 מ”ל של תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) [אשלגן כלורי (200 mg/L), אשלגן פוספט monophasic (200 mg/L), נתרן כלורי (8,000 mg/L) ו אשלגן פוספט diphasic (-2160 mg/L)] לתוך הבארות החיצוניים הנותרים. יש לשטוף השריר זעירים חתיכות 2 x ב- PBS. להפריד אותם לחתיכות קטנות מאוד, עם העזרה של אזמל ו מלקחיים ומניחים חלק קטן (בגודל של קצה הלהב האזמל) בכל הפנימית-16 טוב של המנה רב טוב. למקם את המנה רב טוב בתוך אינקובטור ומתוחזק על התנאים הבאים: 37 ° C, 21% O2ו- 5% CO2. לפקח על הבארות כל יום תחת מיקרוסקופ הפוכה ולהוסיף 50 µL של DF20 במידת הצורך למנוע את התאים ממנו להתייבש.הערה: לאחר כ- 10 ד’, יהיו מספיק תאים צמחה את explant כדי לאפשר בידוד תאי גזע. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. מתי הילה של תאים מוצגת מסביב לשריר explants, למחוק את explant של רקמת שריר. לנתק את התאים על-ידי שימוש µL 150 של פתרון טריפסין המכילה EDTA מכל קידוח: לבטל את המדיום תרבות, לשטוף את התאים עם 1 מ”ל ל- PBS, למחוק את PBS ולהוסיף את הפתרון טריפסין לכל היותר 10 דקות ב 37 º C. להוסיף תרבות בינוני כדי להפסיק את הפעולה של טריפסין הקציר התליה תא, ואז, centrifuge התליה תא ב 200 x גר’ 10 דקות ב 37 º C. למחוק את תגובת שיקוע, להשעות את צניפה תמיסת מלח מאוזנת. העבר התליה תא על צפיפות מקוטע שיפוע של 3 שכבות (15%, 25% ו- 35%). Centrifuge את הצינור המכיל התליה תא והפתרון צפיפות מקוטע ההדרגתי ב x 1,250 גרם במשך 20 דקות ב 25 º C. אל תשתמש בבלמים לצנטריפוגה. להתבונן שברים תא בצפיפויות שונות אשר יופיע בין הרבדים השונים של הפתרון הדרגתיות צפיפות מקוטע לאחר צנטריפוגה. המשך התרבות עם השבר בין 15 ל 25%. להעביר אותו צינור, לשטוף אותו עם הפתרון מלח מאוזנת. Centrifuge התליה תא ב x 200 גר’ 10 דקות ב 37 º C. למחוק את תגובת שיקוע. להמשיך עם השעיית בגדר ב 1 מ”ל של DF20. Prefill בקבוקון התרבות תאים, עם משטח של 25 ס מ2, עם 6 מ של DF20. להעביר את התאים לתוך הבקבוק תרבות תא שמולאו מראש, תרבות אותם בתוך אינקובטור עם התנאים הבאים: 37° C, 21% O2ו- 5% CO2.הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. נטר את התאים כל יום תחת מיקרוסקופ הפוכה. לשנות את המדיום תרבות במידת הצורך (למחוק את המדיום הישן ולהוסיף 6 מ של מדיום חדש של תרבות). לקבוע את המפגש התאית על ידי התבוננות הרבדים תא במנות תרבות, שימוש במיקרוסקופ אופטי בהגדלה גדולה מראש. מעריכים את פני השטח של המנה המאוכלסת על ידי התאים. עובדים בהגדלה מיקרוסקופית קבוע עבור כל התבוננות שניתן יהיה להעריך את המפגש. כאשר התאים לכבוש 85% של פני השטח של המנה, להמשיך עם מעבר של התאים. כאשר התאים confluent, לנתק אותם באמצעות פתרון טריפסין המכילה EDTA באותו הפרוטוקול כפי שמתואר בשלב 2.4. לאחר מכן, centrifuge התליה תא ב x 200 גר’ 10 דקות ב 37 º C. למחוק את תגובת שיקוע, להמשיך resuspension של התאים ב- 5 מ של DF20. למקם אותם לתוך בקבוקון התרבות התא של 175 ס’ ‘ מ2 שמולאו מראש עם 25 מ של DF20. מקם את הבקבוק בתוך אינקובטור עם התנאים הבאים: 37° C, 21% O2ו- 5% CO2.הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. נטר את התאים כל יום תחת מיקרוסקופ הפוכה. לשנות את המדיום במידת הצורך (למחוק את המדיום הישן ולהוסיף 30 מ של מדיום חדש). כאשר התאים confluent, לנתק אותם באמצעות טריפסין-EDTA כפי שמתואר בשלב 2.4. לאחר מכן, centrifuge התליה תא ב x 200 גר’ 10 דקות ב 37 º C. למחוק את תגובת שיקוע, להשעות את התאים 6 מ של DF20. מקום 1 מ”ל של התליה תא לתוך מבחנות 175 ס מ2 6, אחד שמולאו מראש עם 25 מ של DF20, תרבות אותם ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO (עם 21% O2 ו- 5% CO2). נטר את התאים כל יום תחת מיקרוסקופ הפוכה. לשנות את המדיום במידת הצורך (למחוק את המדיום הישן, להוסיף 30 מ של מדיום חדש כל הבקבוק). כאשר התאים confluent, לנתק אותם באמצעות טריפסין-EDTA כפי שמתואר בשלב 2.5. Centrifuge אותם 3 x ב x 200 גר’ 10 דקות 37 ° C, להשליך תגובת שיקוע בכל שלב. לספור את התאים בעזרת Bürker ספירת קאמרית, מיקרוסקופ אור. להכין השעיה הסלולר של 10 מיליון תאים למ”ל של מדיום הקפאה קריוגנית ספציפיים. הקפאה עמוקה טיפולית במינונים של 1 x 10 תאים7 ב- 1 מ”ל של הקפאה קריוגנית בינוני ולאחסן אותם בשלב אדים של חנקן נוזלי עד השימוש שלהם.הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. הספינה התאים המבחנה בקרח יבש לשימוש האחרון. 3. הזרקה של תאי הערה: שני אנשים נדרשים לבצע ההזרקה של תאי גזע. חמים התליה תא בהדרגה לטמפרטורת החדר. האחות ההשעיה לתוך מזרק 2 מ”ל. לסמם את הסוס על ידי הזרקת detomidine 10 µg/kg לתוך ומוחלף על מחט תת-עורית 19 ז. המתן 5 דקות כדי לראות את ההשפעה המלאה של הרגעה, אשר הופך לגלוי במעמד נמוך מאפיין הסוס. קליפ של אזור של 20 x 10 ס מ2 מעל האזור בגרון השמאלי של הסוס עם בטלוויזיה, כפי שמוצג באיור2. לאחר מכן, להחיל קרצוף כירורגית באלכוהול וסבון polyiodide לאזור החתוכים. מקום אנדוסקופ גמיש וידאו רגיל דרך הנחיר השמאלי של הסוס ולקדם אותו לעבר לוע האף. התאם את המיקום של אנדוסקופ עד תצוגה מלאה של הסחוסים arytenoid והן האפיגלוטיס מתקבל. אחוז אנדוסקופ בתנוחה זו במהלך ההליך וסובב את המסך של אנדוסקופ וידאו כלפי המפעילים. לחבר את המחט גירוי הזרקה האלקטרודה השלילית של הקוצב העצבי. לשמור על התנאים סטרילי של המחט. לחבר את האלקטרודה החיובית של הקוצב העצבי תיקון אלקטרודה, שנדבק אל האזור של העור החתוכים. התחבר המזרק המכיל התליה תא לקו הזרקה, prefill צינור כדי לרדוף את האוויר של המערכת. זוכר את אמצעי האחסון של המערכת, להכין מזרק באותו אמצעי אחסון של תמיסת סטרילית. אם לא מוכר עם טכניקה זו, השתמש מתמר אולטרסאונד ליניארי 5 עד 7 מגה-הרץ מחוטא להמחיש את מבנים אנטומיים באזור של ריבית. השתמש אולטרסאונד סטרילי צימוד ג’ל כדי להגדיל את איכות התמונה. דמיינו הגרון ולכלי הפועלות באזור הגבי של הגרון. ברגע מכירים האנטומיה של האזור, להחדיר את המחט הזרקה גירוי לעבר ההיבט דורסולטרלי של הגרון. כאשר אתם ניגשים ההיבט דורסולטרלי של הגרון, להתחיל את הקוצב העצבי במצב גירוי 1 הרץ עם זרם של 2 mA. בעדינות להזיז את המחט לכיוון המיקום של העצב בגרון חוזרים ונשנים תוך התבוננות אנדוסקופי התצוגה על המסך. ברגע החטיפה תנועת שמאל הסחוס הקיתוני מוצגת על מסך וידאו, להפחית את הזרם עד התנועה נעלם תוך שמירה על המחט במקום. לזהות את המיקום האידיאלי של המחט. תחשיב אובדן תגובה מוטורית-0.5 אמא כמו המרחק אידיאלי בין העצב. כאשר הסחוס הקיתוני תנועות מתמידות על זרמים נמוכים יותר 0.4 אמא, לא להזריק את התאים, כמו זה עלול לגרום זריקה intraneuronal. כאשר האובדן של תגובה מוטורית-0.5 mA נצפית, להזריק התליה תא המכיל תאי גזע עצמיים7 10, אשטוף את הזרקת עם תמיסת מלח מוכן בשלב 3.6. זה יהיה להזריק את שאר התליה תא שנשאר בצינור הזרקה. אחרי הזריקה של התאים, להוציא את המחט, אנדוסקופ. תן את הסוס להתאושש הרגעה. אין טיפול נוסף נדרש עבור האתר ביופסיה.

Representative Results

הנציבות לשימוש האתית של חיות של אוניברסיטת והשליט אושר פרוטוקול המחקר. שישה סוסים מן העדר מחקר סוסים במרכז המחקר הרכיבה מונט-le-Soie נכללו במחקר זה. בהסוס הראשון, כאב מקומי העצב בגרון חוזרים ונשנים על ידי electrostimulation. איור 2 מציג את ההגדרה של שימוש, עם מחט גירוי מוכנס לתוך ההיבט דורסולטרלי השמאלי של הגרון של הסוס ב הקוצב העצבי. כאשר האובדן של תנועת הסחוס הקיתוני נצפית ב- 0.5 מוזרק אמא, 1 מ”ל של לידוקאין 2%. כתוצאה מכך היעדרות של התנועה לזרמים גבוהים יותר, של שיתוק חולף של arytenoid השמאלי. אנדוסקופיה שליטה, 24 שעות לאחר מכן, התגלה התאוששות מלאה של הפונקציה arytenoid. פרוטוקול מלא בהצלחה חזר על עצמו בחמישה סוסים. אף אחד הסוסים הראו תגובה שלילית microbiopsy השריר. ב כל הסוסים, מספר מספיק של התאים גדלו בזמן קבוע. אנדוסקופיה דרכי הנשימה העליונות של האורחים בוצעה ע ב כל חמישה סוסים והניקוד פונקציה בגרון אני או II.1 על פי רובינסון. et al. 14 היו נחושים. כל הסוסים נסבל הגירוי העצבי של עצב בגרון חוזרים ונשנים טוב מאוד. אין תגובה שלילית נצפתה במהלך או לאחר הגירוי או ההזרקה של תאי גזע. אנדוסקופיה לכל נרשם, שבוים על ידי שני רופאים עיוור. לא היה הבדל בין ציוני טרום ההזרקה של הפונקציות בגרון לבין בין ציוניהם ביום 1, 7, ו- 28 לאחר הזרקת תאי גזע, כפי שנבדקו על-ידי Wilcoxon ניתוח דרגה15. טבלה 1 מסכמת עשרות סוסים כל נקודות זמן שונות, כמו גם את הזמן של החדרת המחט ההזרקה של תאי גזע והזרם לגרות את התנועה arytenoid בגרון כאשר התאים שבו מוזרק. התאים השתמשו במחקר הנוכחי הוכנו על פי פרוטוקול שפורסם בעבר7. תאים מן כל השברים הצליחו בידול trilineage, הביע CD90 ו- CD44, לא הביעה CD45 ו- MHC II, והיה clonogenic הקיבולות. התאים של השבר 15 – 25% נבחרו עיבוד נוסף משום שהם חשפו את הביטוי הגדול של CD90 ו הקיבולות proliferative הגדול ביותר. מטרת המחקר הנוכחי היתה לא כדי לבדוק את היעילות של היישום תאי גזע להתחדש עצבים היקפיים פגום אבל רק כדי לבחון את הכדאיות של ההליך וכדי להעריך את הבטיחות של הזרקת תאי גזע כדי העצב בגרון חוזרים ונשנים ב בכדור l מספר סוסים בריאים. היעדרות של שינויים פונקציונליים על ההדמיה אנדוסקופי חמש סוסים עד 28 ימים לאחר הזרקת וסוסים היעדרות של סימנים קליניים ב-4 של החמישה עד 1 שנה לאחר הזריקה מאשרת את הכדאיות ואת הבטיחות של ההליך. סוס אחד והיה צורך להרדימם בתקופת המעקב מסיבות שאינן קשורות המחקר. למרות הטכניקות להוכיח להיות בטוח במספר קטן של סוסים, מספר הסוסים כללו במחקר הנוכחי הוא נמוך מדי כדי להדגים היעדרות של מאורעות נדירים. ציון לפני ההזרקה זמן ההזרקה (דקות) זרם-הזרקה (תואר שני) ניקוד-הזרקת פוסט יום 1 התוצאה יום 7 פוסט הזרקה התוצאה 28 יום פוסט הזרקה הסוס 1 (Standardbred, מארה, בן 16) II.1 12 0.5 . אני II.1 II.1 סוס 2 (Standardbred, מארה, בת 22) . אני 3 0.7 . אני . אני . אני סוסים 3 (Standardbred, מארה, בת 11) II.1 4 0.5 II.2 II.1 II.1 סוס 4 (Standardbred, מארה, בת 12) . אני 7 0.5 . אני II.1 . אני הסוס 5 (Standardbred, מארה, בן 10) . אני 3 0.7 II.1 . אני טבלה 1: Signalment, בגרון לתפקד ציונים של הסוסים. טבלה זו מציגה בזמן ההזרקה, הנוכחי הנמוך מעוררות כל תנועה arytenoid לפני הזריקה, ואת התוצאות בגרון של חמישה סוסים בריאה, לפני יום 1, 7, ו- 28 לאחר הזריקה של עצמיים שריר-derived בתאי גזע mesenchymal ב קרבתה העצב השמאלי חוזרים ונשנים בגרון. הסוס #5 לא היה זמין עבור הפקד ב 28 יום לאחר הזריקה מסיבות שאינן קשורות מחקר זה. התוצאות מתייחסות הציונים מתוארת על ידי רובינסון. et al. 14. כאן, ציון אני אומר כי התנועות של הסחוסים arytenoid שניהם היו סינכרונית. וסימטריים, ואת חטיפת שני הסחוסים arytenoid מלאה יכולה להיות מושגת ומתוחזק. ציון II.1 אומר כי התנועות של הסחוסים arytenoid היו אסינכרוני או ייתכן אסימטרי בזמנים מסוימים; עם זאת, חטיפת שני הסחוסים arytenoid מלאה יכול להיות שהושג ומתוחזק. איור 2 : הגדרת במהלך ההזרקה של תאי גזע. המחט גירוי עצבי הוא הציג על הצד השמאלי של הגרון, המופנה כלפי העצב השמאלי בגרון חוזרים ונשנים. הקוצב העצבי מוגדר 0.8 mA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את היישום מוצלח של שרירים-derived תאי גזע עצמיים של העצבים בגרון חוזרים ונשנים אצל סוסים תוך שימוש בגישה מונחה אחד האביזרים המקובלים לגירוי עצבי. היבול של הדגימה microbiopsy השריר, כמו גם הבידוד, תרבות, ואפיון של תאי גזע, תוארו בפירוט בעבר, בזמן ההזרקה של תאים אלה בסמיכות עצבים היקפיים היא המקורי. האלקטרו-הלוקליזציה של העצב עם הקוצב העצבי חשמל שימש לצורך המחקר הנוכחי, שימש כדי להזריק גזע mesenchymal בסמיכות ישירה העצב בגרון חוזרים ונשנים. התגובה המוטורית נוטרה על ידי אנדוסקופיה וידאו דרך לוע האף. אם, במהלך תהליך המיקום של המחט, עצבים אחרים היו מגורה, התנועה המתאימה היה נראה לעין על המסך אנדוסקופיה. גירוי מוצלחת של עצב בגרון חוזרים ונשנים התאפיינה חטיפת הסחוס הקיתוני טיפוסי. ב סוס אחד, הרדמה מקומית הוזרק לזירוז שיתוק חולף של שריר arytenoid. למרות השתלה מוצלחת של התאים בסמיכות העצב לא נבדק במיוחד במחקר הנוכחי, האלקטרו-הלוקליזציה של העצב ואת הזריקה-זרם נמוך הוכיח כי תאי גזע הוחלו ליד העצב. מהקרבה של injectate העצב הודגם עוד יותר על ידי בלוק מנוע מוצלח המושרה על ידי זריקת הרדמה מקומית.

ב הסוסים חמשת הנותרים, הפעם מן הגירוי הראשון עד הזרקת תאי גזע מוצלחת מגוונים בין 3 עד למינימום 12 סוסים היו מעט תרופות הרגעה במהלך ההליך, אשר הגדילה שלהם ציות גירוי חשמלי אף אחד הסוסים הראו תופעות לוואי בכל עת, המציינת את משך הזמן של הגירוי יכול להיות ממושך במידת הצורך להשיג מיקום המחט טוב. עקומת למידה תלולה צפוי להיות נצפתה אם המפעיל משתמש בטכניקה זו באופן קבוע, מספר גדול יותר של סוסים עם האנטומיה בדרגות שונות.

סוסים בדרך כלל סובלים RLN, אשר מאופיין על ידי בדרגות שונות של שיתוק של הסחוס הקיתוני השמאלי שמוביל חריג קולות נשימה ופעילות גופנית חוסר סובלנות. היסטולוגיה של העצבים שנפגעו מגלה נגעים אופייניים של נוירופתיה16. נוירופתיה הוא מונח המשמש לתיאור סוגים שונים של נגעים במערכת העצבים ההיקפית שמוביל לקוי תחושות, תנועות או התפקודים. הגורמים הם משתנה מאוד והוא עשוי לכלול סוכרת, חוסרים תזונתיים, טיפול עם תרופות מסוימות, פציעה טראומטית, איסכמיה או זיהום, או שהם יכולים להיות אידיופטית. עצמאית של הגורם, מחלות עצבים היקפיים לשתף סימנים histopathological נפוצים, כגון וולריאני, axonopathy דיסטלי או סגמנטלי demyelination. הוכח כי הממשל של גזע mesenchymal העצבים ההיקפיים פגום עשוי להיות מועיל עבור התחדשות שלהם; עם זאת, המנגנון הבסיסי אינם מובנים היטב. באופן מסורתי, אנו מאמינים כי גזע mesenchymal רק להבדיל לתוך המוצא לאגס התרבותי שומן, שריר, סחוס רקמת העצם, אך בתנאים מסוימים, הם הוכחו להבדיל לתוך השריר17, האסטרוציטים18 , myelinating תאים של היקפי19 , מערכת העצבים המרכזית19. במהלך תרבות במבחנה , חשיפה neuropeptides יעדיפו את הבידול של גזע mesenchymal לתוך התאים לבטא סמנים עצביים21,22. מספר ויוו מחקרים הראו השפעה מיטיבה של גזע mesenchymal על התחדשות עצבים, החלמה תפקודית במודלים עכברוש של10,פגיעה בעצב23. זה כנראה נגרם עקב תנאים סביבתיים נוחים שתורמים הבידול בתאי גזע לתוך תאי רקמות ספציפיות24. מחקרים עתידיים צריך לבחון גם טכניקה זו עבור המינהל מראש תאים אצל סוסים מושפעות RLN.

למיטב ידיעתנו, זה הדו ח הראשון מתאר את השימוש הקוצב העצבי כדי להתאים לשפה עצבים היקפיים כדי להזריק טיפול מסוים לתוכו. פתולוגיות אחרות במערכת העצבים ההיקפית במינים שונים, כגון כאב נוירופטי, יכולים להיות מטופלים על-ידי המינהל של תאי גזע בסמיכות עצב25,26. מחקרים עתידיים צריך לבחון את ההשפעה של טכניקה זו בחולים קליניים ולחקור את הסיכון של העברת ואת הפוטנציאל של ההתמיינות של התאים מוזרק.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר ממומן על ידי המרכז לחקר אקווין מונט-le-Soie.

Materials

Detomidine (Domidine)  Dechra sold through pharmacy
Lidocaine (Xylocaine)  Movianto sold through pharmacy
TOF Watch S (Nerve stimulator) Alsevia 79950161
TSK Starcut (Biopsy needle) STSK laboratory SAG – 14090C
Electrostimulation needle  Pajunk 001185-79
DMEM – F12 (culture medium) Lonza LO BE12-719F
Heat inactivated FBS Life technologies 10500
Penicillin-streptomycin Lonza DE17-602E
Amphotericin B (Fungizone) Lonza 17-836E
Phospate buffered saline Lonza LO BE17-512F
24-multiwell dish Corning 3524
Trypsin Life technologies 12604
HBSS Lonza LO BE10-508F
Percoll PLUS GE Healthcare 17544502
NaCl Sigma S8776
T-25cm² flasks Nunclon 136196
T-175 cm² flasks Nunclon 178883
Cryostore CS5 Biolife solutions 205373
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
  2. Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
  3. Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
  4. Hahn, C., Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , 9-11 (2003).
  5. Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
  6. Barnett, T. P., O’Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
  7. Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
  8. Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
  9. Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
  10. Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
  11. Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
  12. Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
  13. De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
  14. Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
  15. . The BMJ: Rank Score Tests Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018)
  16. Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
  17. Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
  18. Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
  19. Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
  20. Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
  21. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
  22. Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
  23. Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
  24. Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
  25. Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
  26. Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).

Tags

Nerve StimulatorAutologous Stem CellsEquineLeft Recurrent Laryngeal NervePeripheral NeuropathyEquine Recurrent Laryngeal NeuropathyMinimally InvasiveStem Cell HarvestNerve StimulationMuscle Biopsy14-gauge Biopsy NeedleLidocaineSkin DisinfectionSterile Technique

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sandersen, C., Ceusters, J., Fourez, A., Tosi, I., Graide, H., Lejeune, J., Serteyn, D. Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve. J. Vis. Exp. (139), e58023, doi:10.3791/58023 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image