العصب استرشادا مشجعا حقن الخلايا الجذعية الذاتي قرب عصب حنجري المتكررة الأيسر الخيلي
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لحقن الخلايا الجذعية المشتقة من العضلات ذاتي بالقرب من عصب حنجري المتكررة بالمساعدة من مشجعا العصب الكهربائية. قد يصبح هذا الأسلوب رواية مفيدة لعلاج الخيول الاعتلال العصبي حنجري المتكررة.
Abstract
الاعتلال العصبي حنجري المتكررة (رلن) عادة يصيب الخيول ويتسم بالتعصب الأصوات وممارسة التنفس غير طبيعي. عصب حنجري المتكررة تظهر آفات demyelination. ثبتت فائدة تطبيق الخلايا الجذعية للأعصاب ديميليناتيد في مختلف نماذج حيوانية. وكان الهدف من هذه الدراسة لاختبار جدوى وسلامة حقن الخلايا العصبية المحيطة ذاتي المستمدة من العضلات الخلايا الجذعية الوسيطة إلى اليسار عصب حنجري المتكررة في الخيول صحية باستخدام مشجعا عصب كهربائية.
يتم الحصول على خلية ينبع المستمدة من العضلات من خمسة الخيول Standardbred صحية قبل أخذ العينات 20 ملغ أنسجة العضلات بإبرة خزعة 14 جرام شبه تلقائي من عضلة ثلاثية الرؤوس. حركات الحنجرة يتم رصده عن طريق التنظير الفيديو مجرى الهواء العلوي. اقترب من اليسار عصب حنجري المتكررة مع إبرة معزولة العصب كتلة. تحفيز العصب هو تطبيقها، بدءاً من 2 رصد mA، واختطاف ناجحة أريتينويد اليسرى. يتم تقليل كثافة التحفيز تدريجيا. ويلاحظ عند فقدان الاستجابة الحركية في 0.5 mA، 107 ذاتي المستمدة من العضلات الجذعية يتم حقن الخلايا. نقاط فاحصين اثنين، الذين هم أعمى إلى النقطة الزمنية، الدالة حنجري الخيول قبل العلاج وفي يوم 1، 7، واليوم 28 بعد حقن الخلايا. في حصان السادسة، يتم حقن 1 مل ليدوكائين 2% مزيد تأكيد تحديد المواقع الصحيحة للابرة. وهذا يؤدي إلى شلل مؤقت الغضروف طرجهالي اليسرى.
تثبت هذه الدراسة أنه يمكن تناول عصب حنجري المتكررة بمساعدة مشجعا العصب الكهربائية وأن التحفيز الكهربائي للعصب جيد التحمل بالخيول. لم يلاحظ أي تعديل وظيفة الحنجرة في أي من الخيول بعد حقن الخلايا الجذعية. وينبغي إجراء مزيد من الدراسات لوصف آثار حقن الخلايا العصبية المحيطة ذاتي المستمدة من العضلات الخلايا الجذعية الوسيطة للخيول تعاني من رلن.
Introduction
رلن علم أمراض شائعة من مجرى الهواء العلوي في الخيول التي تتسم بدرجات متفاوتة من الشلل طرجهالي. الأكثر شيوعاً هو أثرت على الجانب الأيسر من الحنجرة. يمكن أن تصل إلى معدل انتشار هذا المرض تصل إلى 35 في المائة في قطاعات معينة من السكان الحصان. على الرغم من أن العديد من الفرضيات حاول أن يشرح والمسببات المرضية لهذا المرض، إلا أن السبب الدقيق رلن لا يزال غير مؤكد. علم الأمراض توصف بأنها axonopathy البعيدة العصب حنجري المتكررة مع الآفات ديمييلينيشن ولكن أيضا درجة معينة من ريميلينيشن. هذا أكسونوباثي يؤدي إلى إزالة التعصيب عضلات الحنجرة الجوهرية وما يصاحب ذلك من ضمور1،2. هذه الأمراض تدريجيا ببطء في كثير من الأحيان، وقد يؤدي إلى خسارة كاملة لاختطاف طرجهالي الجانب المتضررة3.
الخيول المتأثرة تنبعث منها أصوات تنفسية غير طبيعية أثناء ممارسة، وأحيانا، تظهر ممارسة التعصب في الحالات الأكثر شدة. يتم إجراء التشخيص النهائي بفحص بالمنظار على حصان غير مخدراً دائمة حيث لوحظ فقدان جزئي أو كلي لاختطاف حنجري1،،من24. حاليا، العلاج الأكثر شيوعاً لارينجوبلاستي (تعرف أيضا باسم “التعادل خلفية”)، الذي يرتبط في بعض الأحيان مع النخاعية-كورديكتومي. ورغم أن المعدل العام لنجاح هذه العمليات الجراحية تعتبر جيدة إلى ممتازة5، المضاعفات بعد العمليات الجراحية شائعة جداً. المضاعفات الأكثر شيوعاً فقدان تدريجي للاختطاف. بارنيت et al. وأفادت 6 فقدان درجة واحدة على الأقل للاختطاف خلال الأسابيع الستة الأولى بعد الجراحة في 76 في المائة على الأقل من الخيول. مضاعفات أخرى، مثل فشل بدلة، والسعال، والتلوث الجوي، هي أيضا الإبلاغ عن5.
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كانت جزءا من الطب الخيول في البحوث والممارسة لأكثر من عقد، على الرغم من أن تثبت الدراسات على كفاءتها لا تزال نادرة. مصادر الاستغلال الأكثر شيوعاً اثنين من الكبار الخلايا الجذعية الوسيطة في الخيول هي نخاع العظام والأنسجة الدهنية7. كلا أساليب أخذ العينات الغازية نسبيا ولا تؤدي دائماً إلى عدد كاف من الخلايا. في الآونة الأخيرة، سيوستيرس et al. 7 وصف ثقافة الخلايا الجذعية المشتقة من أنسجة العضلات المخططة، التي يتم الحصول عليها بأسلوب ميكروبيوبسي أقل الغازية.
MSCs قادرون على التجديد الذاتي وتوليد الذاتي ومولتيبوتينسي والتمايز7،8. قدرتهم على التمييز في جميع الأنساب mesoderm من الدهون والعظام والعضلات والغضاريف الآن راسخة9. ومع ذلك، تحت ظروف بيئية معينة، أنها يمكن أن تفرق في الأنساب غير الوسيطة مثل الخلايا العصبية، أستروسيتيس، والخلايا ميليناتينج الجهاز العصبي المحيطي والحبل الشوكي9،10. قد استخدمت فعلا MSCs في الاعتلال العصبي عدة نماذج10،11. وقد ثبت قدرتها على الهجرة إلى مناطق تحولت النسيج العصبي وعلى تجديد الخلايا العصبية بعد إدارة الشاملة والمحلية11. وعلاوة على ذلك، يمكن توظيف خلايا شوان تشبه المستمدة من MSCs الضامة إزالة الحطام الخلوية وتفرز نيوروتروفيك عوامل تعزيز النمو محواري وريميلينيشن9.
الهدف من هذه الدراسة وصف تقنية حقن استرشادا مشجعا العصب المستمدة من العضلات الخلايا الجذعية الذاتي قرب عصب حنجري المتكررة الأيسر في الخيول صحية. نموذجياً، يتم استخدام مشجعا الأعصاب متصلة إبرة حقن للكهربائية-إضفاء الطابع المحلي على الأعصاب الطرفية من أجل تطبيق المخدرات الموضعية إلى أن المنطقة12. يتم توفير دفعة ضعف تيار المباشر بالقرب من العصب للحث على استجابة الحركية. القدرة على إنتاج هذه الاستجابة الحركية يعتمد على معلمات متعددة، مثل منطقة موصلة إبرة، أي مقاومة من الأنسجة والحالية المطبقة ومدة النبضة والمسافة من الإبرة في العصب. العصب مشجعا الإبر مصممة لتحتوي على منطقة موصلة تقييدية للغاية في طرف الإبرة، بينما هو معزول بقية الإبرة. ويساعد هذا التصميم إلى دقة ترجمة العصب. المنبهات العصبية الحديثة تتكيف مع اختلاف الأنسجة ممانعات وتوصيل التيار المستمر على الجهاز. وعلاوة على ذلك، تستخدم معظم الآلات مدة نبض 0.1 s، حيث تكون المعلمات محسومة الحالية المطبقة والمسافة إلى الإبرة. يتم وصف العلاقة بين المسافة إبرة للأعصاب والحالية اللازمة لإنتاج استجابة محرك بقانون كولوم في: E = خمس/البحث والتطوير؛ ه هو المسؤول عن تحفيز المطلوبة، k هو ثابت كولوم في، س هو المسؤول عن تحفيز المطلوبة الحد الأدنى، حيث r هي المسافة بين الأقطاب اثنين. في الكهربائية-ترجمة الأعصاب، تعتبر المسافة بين قطبين إبرة للعصب مسافة12. حشوة كهربائية تبدد بعد سيادة مربع معكوس من الإبرة للعصب مسافة13. وقد أظهرت الممارسة السريرية أن المحرك العصبية التحفيز في 0.5 mA ارتباطاً قويا إلى كتلة العصب الناجحة، وأن فقدان الإشارات الحركية في أقل من التيارات سوف يمنع المستخدم من إدارة حقن إينترانيورونال عرضي. الهدف من هذه الدراسة اختبار جدوى وسلامة هذا الأسلوب في عدد محدود من الخيول. إذا ثبتت جدوى وسلامة هذا الأسلوب، يمكن نقلها بسهولة إلى الخيول المتأثرة. كذلك، الخيول رلن يمكن أن تستخدم كنموذج للاعتلال العصبي المحيطي التنكسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول التطبيق الناجح للخلايا الجذعية الذاتي المستمدة من العضلات للأعصاب حنجري المتكررة في الخيول باستخدام نهج استرشادا مشجعا عصب. وقد وصف الحصاد العينة ميكروبيوبسي العضلات، فضلا عن العزلة والثقافة، وتوصيف الخلايا الجذعية، بالتفصيل من قبل، بينما حقن هذه الخلايا بالقرب من الأعصاب طرفية الأصلي. الكهربائية-إضفاء الطابع المحلي على العصب مع مشجعا عصب كهربائية خدم لهذه الدراسة، وكان يستخدم لحقن الخلايا الجذعية الوسيطة في الجوار المباشر للعصب حنجري المتكررة. وراقب التنظير الفيديو عن طريق البلعوم الأنفي الاستجابة الحركية. إذا، أثناء عملية تحديد المواقع من الإبرة، حفز أعصاب أخرى، كانت الحركة المقابلة مرئياً على الشاشة التنظير. حفز نجاح العصب حنجري المتكررة اتسمت باختطاف الغضروف طرجهالي نموذجية. في حصان واحد، تم حقن مخدر موضعي للحث على شل العضلات طرجهالي عابرة. على الرغم من أن لم يتم اختباره نجاح زرع الخلايا بالقرب من العصب على وجه التحديد في هذه الدراسة، أثبتت الكهربائية-إضفاء الطابع المحلي على الأعصاب وحقن الحالية منخفضة أن الخلايا الجذعية طبقت قرب العصب. وتجلى بقرب إينجيكتاتي في العصب كذلك كتلة محرك ناجح الناجم عن حقن مخدر موضعي.
في الخيول الخمسة المتبقية، الوقت من التحفيز الأول حتى حقن الخلايا الجذعية النجاح تتباين من 3 إلى 12 دقيقة الخيول كانت طفيفة مخدراً أثناء الإجراء، الذي زاد من امتثالها للتحفيز الكهربائي. لم يظهر أي من الخيول ردود الفعل السلبية في أي وقت، مشيراً إلى أن مدة التنشيط يمكن إطالة إذا لزم الأمر للحصول على إبرة جيدة لتحديد المواقع. ومن المتوقع حاد منحنى التعلم التي سيحتفل بها إذا كان المشغل هو استخدام هذه التقنية بانتظام وفي عدد أكبر من الخيول مع تشريح متفاوتة.
عادة الخيول تعاني من رلن، التي تتسم بدرجات متفاوتة من الشلل الذي أصاب الغضروف طرجهالي اليسرى مما أدى إلى أصوات تنفسية غير طبيعية وممارسة التعصب. الأنسجة الأعصاب المتأثرة يكشف آفات نموذجية من الاعتلال العصبي المحيطي16. اعتلال الأعصاب المحيطية مصطلح يستخدم لوصف أنواع مختلفة من آفات الأعصاب المحيطية مما يؤدي إلى ضعف الأحاسيس أو حركات أو وظائف الجهاز. وأسباب اختلافاً كبيرا ويمكن أن تشمل مرض السكري، والمغذيات، علاج بعقاقير معينة، إصابات الرضية، الاسكيمية، أو عدوى، أو أنها يمكن أن تكون مجهولة السبب. مستقلة عن السبب، اعتلالات الأعصاب المحيطية حصة علامات نسيجية الشائعة، مثل انحطاط واليريان أو axonopathy البعيدة demyelination المجزأ. وقد ثبت أن إدارة الخلايا الجذعية الوسيطة إلى تلف الأعصاب الطرفية قد تكون مفيدة لانتهاء التجديد؛ ومع ذلك، ليست مفهومة جيدا الآليات الكامنة. تقليديا، ونحن نعتقد أن الخلايا الجذعية الوسيطة سوف تفرق فقط في موروث من الدهنية والعضلات والغضاريف وأنسجة العظام، ولكن تحت شروط معينة، قد ثبت أن تفرق في ميوسيتيس17، أستروسيتيس18 ، والخلايا ميليناتينج الطرفية19 والجهاز العصبي المركزي19. أثناء وجود ثقافة في المختبر ، سوف يفضلون تعرض إلى neuropeptides التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة في خلايا معربا عن علامات العصبية21،22. أظهرت العديد من الدراسات في فيفو الآثار المفيدة للخلايا الجذعية الوسيطة في العصب التجدد وانتعاش وظيفية في نماذج الفئران للعصب الوركي إصابة10،23. ربما يحدث هذا بسبب الظروف البيئية المواتية التي تسهم في التفريق بين الخلايا الجذعية إلى خلايا الأنسجة على حدة24. وينبغي التحقيق الدراسات المستقبلية أيضا هذا الأسلوب لإدارة خلايا متمايزة مسبقاً في الخيول المتأثرة رلن.
على حد علمنا، هذا هو التقرير الأول الذي يصف استخدام مشجعا العصب لتعريب الأعصاب طرفية من أجل حقن علاج محدد في ذلك. أمراض الأعصاب المحيطية الأخرى في الأنواع المختلفة، مثل الأم الأعصاب، يمكن أن تعامل الإدارة للخلايا الجذعية بالقرب من25،الأعصاب26. ينبغي اختبار تأثير هذا الأسلوب في المرضى السريرية الدراسات المستقبلية والتحقيق خطر الهجرة والإمكانات للتفريق بين حقن الخلايا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من مركز بحوث الخيول مونت-لو-سويى.
Materials
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG – 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM – F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Hahn, C., Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O’Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- . The BMJ: Rank Score Tests Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018)
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).
