Etiqueta-libre neutrófilo enriquecimiento de la secreción de la vía aérea paciente derivado mediante microfluídica inercial de lazo cerrado
Summary
En esta investigación, se demuestra un método de separación libre de etiqueta neutrófilo de clínica las secreciones mediante la operación de circuito cerrado de la microfluídica inercial espiral. El método propuesto expandiría los ensayos clínicos en vitro para diversas enfermedades respiratorias.
Abstract
Las secreciones contienen una gran cantidad de células de inmune, por ejemplo, neutrófilos, macrófagos y linfocitos, que se pueden utilizar como un recurso importante para evaluar una variedad de enfermedades pulmonares, tanto para fines de investigación y clínicos. Sin embargo, debido a la naturaleza heterogénea y viscosa de moco paciente, hay actualmente ningún método confiable de disociación que no daña las células inmunes del anfitrión en la secreción de la vía aérea paciente. En esta investigación, presentamos un método de preparación de muestra que utiliza la inercia microfluídica para evaluación inmunológica del paciente. Independientemente de las propiedades fluídicas heterogéneas de las muestras clínicas, el método propuesto recupera más del 95% de los neutrófilos de las muestras de secreción de las vías respiratorias que se diluyen 1,000-fold ml de solución salina limpia. Por el flujo de salida concentrado para el depósito de la muestra inicial de recirculación, se proporcionan una alta concentración, recuperación y pureza de las células inmunes; recirculación se considera una relación inversa a la solo jeringa basado funcionamiento de la microfluídica inercial. La operación de circuito cerrado de la microfluídica espiral proporciona leucocitos sin perturbación física o química, como lo demuestra el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)-inducida por la liberación de elastasa de neutrófilos ordenados.
Introduction
Puesto que las células están encapsuladas en una gran cantidad de moco en las secreciones de la vía aérea, la evaluación funcional de los leucocitos por un análisis en vitro ha sido obstaculizada. Ditiotreitol (DTT) es el más común buffer de lisis a disociar y homogeneizar el esputo para análisis citológico y la detección de mediadores al tiempo que proporciona viabilidad tolerable de células aisladas1,2. Sin embargo, TDT puede interferir con antígenos enlazados a la superficie de los neutrófilos en las vías respiratorias, dando por resultado la interrupción de la función del neutrófilo como elastasa y mieloperoxidasa (MPO) liberan2,3. Por lo tanto, se han realizado pocos estudios de la función del neutrófilo humano vía aérea con los neutrófilos de sangre periférica, que no pueden revelar las características fisiológicas de pulmonar4. Mientras tanto, microfluídica inercia ha hecho avances en el aislamiento de las células de varios pacientes biomatrices5,6. El equilibrio entre las fuerzas inerciales elevación y arrastre de Dean alinea la partículas de la célula según su tamaño, que permite la separación de partículas sin etiqueta7. Nuestro grupo ya presentó un método de preparación de muestra para hacer circular el tumor las células8,9, patógenos en sangre8, las células de una suspensión cultura10,11, 12y leucocitos polimorfonucleares (PMNs) de sangre13,14.
Aquí, presentamos un protocolo para preparar las células inmunes de las secreciones de las vías respiratorias de un paciente mediante microfluídica inercial de lazo cerrado para un análisis de aguas abajo en vitro , tales como el ensayo de elastasa (NE). Este método proporciona alta concentración y recuperación, especialmente cuando hay una superposición significativa en el sentido lateral de la célula/partícula de que la célula/partículas de interés debe eliminarse, que es comúnmente observado en muestras clínicas. Por la pared interna (IW) de recirculación-enfocadas grandes partículas o células hacia el tubo de muestra de entrada, la partícula o célula de interés concentrados en el depósito original, mientras que fluidos de fondo con agregados de mucina pequeños pasan por el depósito de residuos. A pesar de las heterogéneas propiedades fluídicas de muestras clínicas, el método propuesto se recupera constantemente sobre el 95% de los neutrófilos de las muestras de secreción de las vías respiratorias que se diluyen 1,000-fold con una solución salina limpia (~ 1 mL). Por el contrario, el método de lisis presenta una amplia gama de PMNs tasas de recuperación dependiendo de la condición de la muestra. El protocolo propuesto captura leucocitos de manera libre de etiqueta sin interrupciones físicas o químicas, que ofrece la posibilidad de cosechar células delicadas de desafío clínico biometría con procedimientos mínimamente invasivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En microfluídica inercial, partículas y células de localización en una determinada posición lateral en un canal de micro basado en su tamaño5,18,19,20. Debido al efecto combinado del Decano arrastre fuerza y la fuerza inercial elevación curvada microchannel, partículas grandes o de neutrófilos (> 10 μm) se encuentran dentro del canal y pequeñas partículas, agregados de moco y residu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por NIH/NIAID (R21AI119042) así como el programa de ensayo NIH U24 muestra escasamente (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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