Этикетка бесплатно нейтрофилов обогащения от секрецию дыхательные пути пациента, полученных с помощью замкнутых инерционного микрофлюидика
Summary
В этом исследовании мы демонстрируем метода метку бесплатно нейтрофилов разделения от клинических дыхательных путей выделениями, используя замкнутого цикла эксплуатации спираль инерционного микрофлюидика. Предложенный метод расширит клинических в vitro анализов для различных респираторных заболеваний.
Abstract
Дыхательных путей выделениями содержат большое количество связанных с иммунной клетки, например, нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты, которые могут быть использованы в качестве основных ресурсов для оценки различных легочных заболеваний, как для научных исследований и клинических целей. Однако из-за разнородных и вязких характер пациента слизи, в настоящее время нет надежных диссоциации метод, который не повредить принимающей иммунные клетки в дыхательные пути пациента секрецию. В этом исследовании мы представляем пример подготовка метод, который использует инерционного микрофлюидика иммунной оценки пациента. Независимо от свойства гетерогенных аэрогидродинамических клинических образцов, предложенный метод восстанавливает более чем 95% нейтрофилов из дыхательных путей секрецию образцы, которые разбавляют Гарибова миллилитрами чистой соленой. По рециркуляции концентрированной выходной поток для первоначальной выборки водохранилище, предоставляются высокой концентрации, восстановления и чистоту иммунных клеток; рециркуляция считается компромисс для работы на основе шприц сингл запуск инерционного микрофлюидика. Замкнутого цикла эксплуатации спираль микрофлюидика обеспечивает лейкоциты без физического или химического вмешательства, как продемонстрировано phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)-индуцированной эластазы релиз отсортированных нейтрофилов.
Introduction
Поскольку клетки инкапсулированы в большое количество слизи в дыхательных путей выделениями, функциональной оценки лейкоцитов в assay в vitro был затруднен. Дитиотреитол (DTT) является наиболее распространенным буфера lysis отмежеваться и гомогенизации мокроты для цитологического анализа и выявления посредников обеспечивая допустимых жизнеспособность изолированных клеток в1,2. Однако DTT может помешать с привязкой к поверхности антигены сократимость нейтрофилов, что приводит к нарушению нейтрофилов функции такие как эластазы и миелопероксидаза (МПО) релиз2,3. Таким образом было проведено несколько исследований человеческого сократимость нейтрофилов функции с нейтрофилов периферической крови, которые могут не выявить физиологические характеристики легочной4. Тем временем инерционного микрофлюидика добилась успехов в изоляции клетки от различных пациентов biomatrices5,6. Равновесие между инерционного подъем сил и перетащите Дин выравнивает частиц/ячейку согласно их размер, который позволяет лейбл свободной частицы разделения7. Наша группа ранее представил метод подготовки образца для распространения опухоли клетки8,9, патогенов в крови8, клетки от подвеска культуры10,11, 12и полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ) от крови13,14.
Здесь мы представляем протокол подготовить иммунные клетки от пациента выделениями дыхательных путей с помощью замкнутых инерционного микрофлюидика для вниз по течению в vitro assay, таких как assay нейтрофилов эластазы (NE). Этот метод обеспечивает высокую концентрацию и восстановления, особенно когда есть значительное перекрытие в боковой направлении клеток/частиц из которого клеток/частиц из интерес является быть удалены, который обычно наблюдается в клинических пробах. По рециркуляции Внутренняя стена (IW)-сосредоточены крупные частицы или ячейки ввода образца трубки, частицы или ячейки интерес концентратов в оригинальной водохранилище, в то время как фон жидкости с небольшой муцина агрегаты проходят через отходов водохранилище. Несмотря на свойства гетерогенных аэрогидродинамических клинических образцов, предложенный метод восстанавливает последовательно выше 95% нейтрофилов из дыхательных путей секрецию образцы, которые разбавляют Гарибова с чистой физиологическим раствором (~ 1 мл). Напротив метод лизис представляет широкий ассортимент ПНЛ ставок возмещения в зависимости от состояния образца. Предлагаемый протокол захватывает лейкоциты образом ярлык бесплатно без физического или химического перерывов, который обеспечивает возможность собрать тонкие клетки от клинически сложных Биометрия с минимально инвазивных процедур.
Protocol
Representative Results
Discussion
В инерциальной микрофлюидика частиц и клетки локализовать в определённой боковой позиции в микро канал, основанный на их размер5,18,19,20. Из-за совокупный эффект декан перетащите силы и инерционных подъемная сила в изо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH/NIAID (R21AI119042) а также NIH U24 образца щадящие пробирного программы (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
