Label-free del neutrofilo arricchimento da secrezione di paziente-derivato della via aerea utilizzando microfluidica inerziale Closed-loop
Summary
In questa ricerca, dimostriamo un metodo privo di etichetta del neutrofilo separazione da clinica delle secrezioni bronchiali mediante operazione di ciclo chiuso della microfluidica inerziale a spirale. Il metodo proposto sarebbe espandere i dosaggi clinici in vitro per varie malattie respiratorie.
Abstract
Delle secrezioni bronchiali contengono un gran numero di cellule immuno-correlati, ad esempio, neutrofili, macrofagi e linfociti, utilizzabile come una risorsa importante per valutare una varietà di malattie polmonari, sia per scopi di ricerca e clinici. Tuttavia, a causa della natura eterogenea e viscosa del paziente muco, non c’è attualmente nessun metodo di dissociazione affidabile che non danneggia le cellule immuni ospite nella secrezione paziente delle vie respiratorie. In questa ricerca, vi presentiamo un metodo di preparazione del campione che utilizza microfluidica inerziale per la valutazione del sistema immunitario del paziente. Indipendentemente dalla proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto consente di recuperare oltre il 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con millilitri di soluzione fisiologica pulito. Di ricircolo nel flusso di output concentrato al serbatoio del campione iniziale, un’alta concentrazione, il recupero e la purezza delle cellule immunitarie sono forniti; ricircolo è considerato un compromesso per l’operazione di basata su siringa di singolo conduzione della microfluidica inerziale. L’operazione di regolazione della spirale microfluidica fornisce leucociti senza disturbo fisico o chimico, come dimostrato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-indotto rilascio dell’elastasi dei neutrofili ordinati.
Introduction
Poiché le celle sono incapsulate in una grande quantità di muco nelle secrezioni delle vie respiratorie, la valutazione funzionale dei leucociti mediante saggio in vitro è stata ostacolata. Ditiotreitolo (DTT) è il più comune buffer di lisi di dissociare e omogeneizzare l’espettorato per l’analisi citologica e rilevamento dei mediatori fornendo al contempo tollerabile attuabilità delle cellule isolate1,2. Tuttavia, DTT può interferire con gli antigeni di superficie associato dei neutrofili delle vie respiratorie, causando l’interruzione della funzione del neutrofilo ad esempio elastasi e mieloperossidasi (MPO) versione2,3. Pertanto, sono stati condotti pochi studi di funzione del neutrofilo umano della via aerea con neutrofili periferici di anima, che non possono rivelare le caratteristiche fisiologiche della polmonare4. Nel frattempo, microfluidica inerzia ha fatto progressi nell’isolare cellule da vari pazienti BIOMATRICI5,6. L’equilibrio tra le forze inerziali ascensore e Dean trascinamento consente di allineare la particella/cella in base alle loro dimensioni, che permette la separazione di particelle privo di etichetta7. Il nostro gruppo precedentemente introdotto un metodo di preparazione del campione per la circolazione del tumore le cellule8,9, agenti patogeni nel sangue8, cellule da una sospensione cultura10,11, 12ed i leucociti polimorfonucleari (PMNs) dal sangue13,14.
Qui, presentiamo un protocollo per preparare le cellule immuni dalle secrezioni delle vie aeree di un paziente con circuito chiuso inerziale microfluidica per un’analisi a valle in vitro , ad esempio, il saggio di elastasi del neutrofilo (NE). Questo metodo fornisce alta concentrazione e il recupero, soprattutto quando c’è una sovrapposizione significativa nella direzione laterale della cella/particella da cui la cellula/particelle di interesse deve essere rimosso, che è osservata comunemente in campioni clinici. Di ricircolo interno parete (IW)-messo a fuoco grandi particelle o cellule torna al tubo di campionamento, la particella o cella di interesse concentrati nel serbatoio originale, mentre fluidi di sfondo con aggregati di piccole mucina passano attraverso il serbatoio di scarico. Nonostante la proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto recupera costantemente superiore al 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con una soluzione pulita Salina (~ 1 mL). Al contrario, il metodo di lisi presenta una vasta gamma di PMNs tassi di recupero a seconda delle condizioni del campione. Proposta di protocollo cattura leucociti in modo privo di etichetta senza nessun danno fisico o chimico, che fornisce la possibilità di raccogliere le cellule delicate da clinicamente impegnativo biometria con procedure mini-invasive.
Protocol
Representative Results
Discussion
In inerziale microfluidica, particelle e cellule localizzano in una certa posizione laterale in un micro-canale basato sul loro formato5,18,19,20. Dovuto all’effetto combinato del decano trascina la forza e la forza inerziale ascensore nel microchannel curvo, particelle di grandi dimensioni o i neutrofili (> 10 µm) sono situati all’interno del canale e piccole particelle, aggregati di muco e d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIAID (R21AI119042) così come il programma di dosaggio NIH U24 campione con parsimonia (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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