Label-free Neutrophil enrichissement de sécrétion Patient provenant des voies respiratoires à l’aide de la boucle fermée Microfluidics inertiel
Summary
Dans cette recherche, nous démontrons une méthode de séparation neutrophiles exempte d’étiquette de sécrétions des voies respiratoires clinique utilisant opération de boucle fermée de spirale microfluidics inertiel. La méthode proposée élargirait les essais cliniques in vitro pour diverses maladies respiratoires.
Abstract
Les sécrétions des voies aériennes contiennent un grand nombre de cellules immunitaires, par exemple, les neutrophiles, les macrophages et lymphocytes, qui peuvent être utilisés comme une ressource majeure pour évaluer une variété de maladies pulmonaires, tant pour la recherche et à des fins cliniques. Toutefois, en raison de la nature hétérogène et visqueuse de mucus patients, il n’y a actuellement aucune méthode fiable de dissociation qui n’endommage pas les cellules immunitaires de l’hôte dans la sécrétion bronchique patients. Dans cette recherche, nous présentons une méthode de préparation d’échantillon qui utilise microfluidics inertiel pour évaluation immunitaire du patient. Quelles que soient les propriétés fluidiques hétérogènes des échantillons cliniques, la méthode proposée remet plus de 95 % de neutrophiles d’échantillons de sécrétion des voies respiratoires qui sont dilués 1000 avec millilitres de solution saline propre. Par recirculation le flux de sortie concentrée vers le réservoir de l’échantillon initial, une forte concentration, la récupération et la pureté des cellules immunitaires sont fournis ; recirculation est considéré comme un compromis à l’opération d’axée sur la seringue unique-run de microfluidique inertielle. L’opération de boucle fermée de spirale microfluidics fournit des leucocytes sans perturbation physique ou chimique, comme en témoigne le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)-induite par le communiqué de l’élastase des neutrophiles triés.
Introduction
Étant donné que les cellules sont encapsulées dans une grande quantité de mucus dans les sécrétions des voies respiratoires, l’évaluation fonctionnelle des leucocytes par un test in vitro a été entravée. Le dithiothréitol (DTT) est la plus courant tampon de lyse à dissocier et homogénéiser les crachats pour analyse cytologique et la détection des médiateurs tout en assurant la viabilité tolérable de cellules isolées1,2. Cependant, DTT peut interférer avec les antigènes de surface-bondissent des neutrophiles des voies respiratoires, entraînant l’interruption des neutrophile fonction telles que l’élastase et la myéloperoxydase (MPO) version2,3. Par conséquent, peu d’études sur les neutrophiles fonction pulmonaire humain ont été menées avec les neutrophiles circulants, qui peuvent ne pas révéler les caractéristiques physiologiques de pulmonaire4. Pendant ce temps, microfluidique inertielle a progressé à isoler les cellules de différents patients biomatrices5,6. L’équilibre entre les forces de levage inertiel et Dean drag aligne la particule/cellule selon leur taille, qui permet la séparation de particules libres label7. Notre groupe précédemment introduit une méthode de préparation d’échantillon pour faire circuler la tumeur cellules8,9, les agents pathogènes dans le sang8, les cellules une suspension culture10,11, 12et polynucléaires (PN) du sang13,14.
Ici, nous introduisons un protocole visant à préparer les cellules immunitaires dans les sécrétions des voies aériennes du patient à l’aide de boucle fermée microfluidics inertiel pour un dosage en aval in vitro , tels que l’essai de l’élastase neutrophile (NE). Cette méthode fournit la forte concentration et récupération, surtout quand il y a un chevauchement significatif dans le sens latéral de la cellule/particule dont la cellule/particule d’intérêt doit être enlevé, qui est fréquemment observé dans les échantillons cliniques. Par la paroi intérieure (IW) de recirculation-axé sur les grosses particules ou cellules vers le tube d’échantillonnage en entrée, la particule ou cellule d’intérêts concentrés dans le réservoir d’origine, tandis que les fluides de fond avec des agrégats de mucine petits traversent le réservoir de déchets. Malgré les propriétés fluidiques hétérogènes d’échantillons cliniques, la méthode proposée récupère constamment au-dessus de 95 % des neutrophiles, des échantillons de sécrétion des voies respiratoires qui sont dilués 1000 avec une solution saline propre (~ 1 mL). En revanche, la méthode de lyse propose une large gamme de PMN taux de recouvrement selon l’état de l’échantillon. La proposition de protocole capture des leucocytes dans une manière sans étiquette sans perturbation physique ou chimique, qui prévoit la possibilité de récolter des cellules délicates de contester cliniquement biométrie aux procédures minimalement invasives.
Protocol
Representative Results
Discussion
En microfluidique inertielle, particules et cellules localiser à une certaine position latérale dans une micro-chaîne basée sur leur taille5,18,19,20. En raison de l’effet combiné du doyen glisser la force et la force inertielle ascenseur à microcanaux incurvé, grosses particules ou neutrophiles (> 10 µm) sont situés à l’intérieur du canal et petites particules, agrégats de mucu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH/NIAID (R21AI119042) ainsi que du programme de test de NIH U24 échantillon épargnant (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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