Livre de rótulo neutrófilo enriquecimento de secreção do paciente-derivado das vias aéreas usando microfluídica inercial de circuito fechado
Summary
Nesta pesquisa, vamos demonstrar um método de separação de neutrófilos rótulo livre de secreções clínico das vias aéreas utilizando a operação de circuito fechado de microfluídica inercial espiral. O método proposto poderia expandir os ensaios clínicos em vitro para várias doenças respiratórias.
Abstract
Secreções das vias respiratórias contêm um grande número de células imune-relacionados, por exemplo, os neutrófilos, macrófagos e linfócitos, que podem ser usados como um recurso importante para avaliar uma variedade de doenças pulmonares, tanto para fins clínicos e de pesquisa. No entanto, devido à natureza heterogênea e viscosa do muco do paciente, não há atualmente nenhum método de dissociação confiável que não danifica as células imunes do anfitrião na secreção das vias aéreas de pacientes. Nesta pesquisa, apresentamos um método de preparação de amostra que usa microfluídica inercial para avaliação imunológica do paciente. Independentemente das heterogêneas fluídico propriedades das amostras clínicas, o método proposto se recupera mais de 95% de neutrófilos de amostras de secreção das vias aéreas que são diluídas 1,000-fold com mililitros de solução salina limpo. Recirculando o fluxo de saída concentrada para o reservatório de amostra inicial, uma alta concentração, recuperação e pureza das células imunes são fornecidos; recirculação é considerada um trade-off para o single-executar operação baseada em seringa de microfluídica inercial. A operação de circuito fechado de microfluídica espiral fornece leucócitos sem perturbação física ou química, como demonstrado pelo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA)-induzida liberação de elastase de neutrófilos classificadas.
Introduction
Uma vez que as células são encapsuladas em uma grande quantidade de muco nas secreções das vias respiratórias, a avaliação funcional dos leucócitos por um ensaio em vitro tem sido prejudicada. Ditiotreitol (DTT) é o mais comum do lysis dissociar e homogeneizar o muco para análise citológica e detecção de mediadores proporcionando viabilidade tolerável de células isoladas1,2. No entanto, TDT pode interferir com antígenos de superfície limite de neutrófilos de vias aéreas, resultando em interrupção da função dos neutrófilos, tais como elastase e mieloperoxidase (MPO) versão2,3. Portanto, foram realizados poucos estudos da função dos neutrófilos via aérea humana com os neutrófilos do sangue periférico, que não podem revelar as características fisiológicas do pulmonar4. Enquanto isso, inercial microfluídica tem feito progressos em isolar as células de vários pacientes biomatrices5,6. O equilíbrio entre as forças inerciais elevador e Dean arrastar alinha a partícula/célula de acordo com seu tamanho, o que permite a separação de partículas livre de rótulo7. Nosso grupo anteriormente introduziu um método de preparação de amostra para circulação de células de tumor8,9, patógenos no sangue8, células de uma suspensão cultura10,11, 12e leucócitos polimorfonucleares (PMN) de sangue13,14.
Aqui, apresentamos um protocolo para preparar as pilhas imunes de secreções de vias aéreas do paciente usando microfluídica inercial de loop fechado para um ensaio a jusante em vitro , tais como o ensaio de neutrófilos elastase (NE). Este método fornece alta concentração e recuperação, especialmente quando existe uma sobreposição significativa na direção lateral da célula/partícula do qual o célula/partícula de interesse está a ser removido, que é comumente observada em amostras clínicas. Recirculando a parede interna (IW)-concentrado de partículas grandes ou células de volta para o tubo de entrada de amostra, a partícula ou célula de interesse concentrados no reservatório original, enquanto fluidos de fundo com agregados de mucina pequenas passam através do reservatório de resíduos. Apesar das propriedades fluídico heterogêneas de amostras clínicas, o método proposto recupera consistentemente acima de 95% de neutrófilos de amostras de secreção das vias aéreas que são diluídas 1,000-fold com uma solução salina limpo (~ 1 mL). Por outro lado, o método de Lise apresenta uma ampla gama de PMN taxas de recuperação, dependendo da condição da amostra. O protocolo proposto captura leucócitos de uma forma livre de rótulo sem interrupções físicas ou químicas, que prevê a possibilidade de colher células delicadas de contestar clinicamente biometria com procedimentos minimamente invasivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em microfluídica inercial, partículas e células localiza-se em uma certa posição lateral em um micro-channel baseado em seu tamanho5,18,19,20. Devido ao efeito combinado do reitor arrastar a força e a força inercial elevador na curva microchannel, partículas grandes ou neutrófilos (> 10 µm) estão localizados dentro do canal e pequenas partículas, agregados de muco e detritos menor q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH/NIAID (R21AI119042) bem como o programa de ensaio NIH U24 amostra poupadores (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
