Markierungsfreie Neutrophilenzahl Anreicherung von Patienten abgeleitet Airway-Sekretion mit Closed-Loop Inertial Mikrofluidik
Summary
In dieser Forschung zeigen wir markierungsfreie Neutrophilenzahl Trennverfahren von klinischen Atemwege Sekrete mit geschlossenen Regelkreis der Spirale inertial Mikrofluidik. Die vorgeschlagene Methode würde die klinische in-vitro- Tests für verschiedene Erkrankungen der Atemwege zu erweitern.
Abstract
Atemwege Sekrete enthalten eine große Anzahl von immunvermittelte Zellen, z. B.Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten, die als eine wichtige Ressource verwendet werden können, um eine Vielzahl von Lungenerkrankungen, sowohl für Forschung und klinische Zwecke zu bewerten. Aufgrund der heterogenen und Viskose von Patienten Schleim ist jedoch derzeit keine zuverlässige Dissoziation-Methode, die die Host Immunzellen in die Patienten Airway-Sekretion nicht schadet. In dieser Studie stellen wir eine Probe Vorbereitung Methode, die trägen Mikrofluidik immun Beurteilung des Patienten verwendet. Unabhängig von den heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften der klinischen Proben, die vorgeschlagene Methode erholt mehr als 95 % der Neutrophilen Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit Milliliter sauber Kochsalzlösung. Durch Rezirkulation konzentrierte Ausgabedatenstrom Erstmuster-Reservoir, sind eine hohe Konzentration, die Wiederherstellung und die Reinheit der Immunzellen zur Verfügung gestellt; Rezirkulation gilt einen Kompromiss für den Einzel-Lauf Spritze ansässige Betrieb des inertialen Mikrofluidik. Der geschlossene Betrieb der Spirale Mikrofluidik bietet Leukozyten ohne physikalische oder chemische Störungen, wie Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) zeigt-induzierte sortierte neutrophile Elastase Freilassung.
Introduction
Da Zellen in einer großen Menge von Schleim in den Atemwegen Sekrete gekapselt sind, hat die funktionelle Beurteilung der Leukozyten durch eine in-vitro- Assay behindert. Dithiothreitol (DTT) ist der häufigste Lyse-Puffer zu distanzieren und homogenisieren Sputum für zytologische Analyse und Erkennung von Mediatoren und bietet gleichzeitig erträglich Lebensfähigkeit der isolierten Zellen1,2. Jedoch kann DVB-t stören Oberfläche-gebundene Antigene der Atemwege Neutrophilen, wodurch die Störung der Neutrophilen Funktion wie z. B. die Elastase und Myeloperoxidase (MPO)2,3. Daher wurden nur wenige Studien der menschlichen Atemwege Neutrophilenzahl Funktion mit peripherem Blut neutrophile durchgeführt, die nicht die physiologischen Eigenschaften der pulmonalen4verraten kann. Unterdessen hat sich träge Mikrofluidik Fortschritte bei der Isolierung von Zellen aus verschiedenen Patienten Biomatrices5,6. Das Gleichgewicht zwischen inertial Aufzug Kräfte und Dean ziehen richtet die Partikel/Zelle gemäß ihrer Größe die markierungsfreie Partikel Trennung7ermöglicht. Unsere Gruppe zuvor führte eine Probe Zubereitungsart für zirkulierenden Tumor Zellen8,9, Krankheitserreger im Blut8, Zellen aus einer Suspension Kultur10,11, 12, und Polymorphkernige Leukozyten (PMNs) von Blut13,14.
Hier stellen wir ein Protokoll um Immunzellen des Patienten Airway Sekrete mit geschlossenen inertial Mikrofluidik für einen nachgeschalteten in-Vitro -Assay, wie der Neutrophilen Elastase (NE)-Test vorzubereiten. Diese Methode bietet hohe Konzentration und Erholung, vor allem wenn es eine deutliche Überschneidung in seitlicher Richtung der Zelle/Teilchen aus dem die Zelle/Partikel des Interesses ist zu entfernen, die häufig in klinischen Proben beobachtet wird. Durch Rezirkulation der inneren Mauer (IW)-große Partikel oder Zellen zurück zu der Eingabe Probenröhrchen, die Partikel oder Zelle-of-Interest-Konzentrate im ursprünglichen Behälter konzentrieren, während Hintergrund Flüssigkeiten mit kleinen Mucin Aggregate durch den Abfall Behälter übergeben. Trotz der heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften von klinischen Proben, erholt sich die vorgeschlagene Methode konsequent über 95 % der Neutrophilen aus Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit einer sauberen Kochsalzlösung (~ 1 mL). Im Gegensatz dazu stellt die Lyse-Methode eine breite Palette von PMNs Verwertungsquoten je nach dem Zustand der Probe. Das vorgeschlagene Protokoll erfasst Leukozyten in gewissem markierungsfreie ohne physikalische oder chemische Unterbrechung, bietet die Möglichkeit, empfindliche Zellen aus klinisch gegen Biometrie mit minimal-invasiven Eingriffen zu ernten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inertial Mikrofluidik lokalisieren Partikel- und Zellen an einer bestimmten seitlichen Position in einem Mikro-Kanal anhand ihrer Größe5,18,19,20. Durch die kombinierte Wirkung des Dekans zu ziehen, Kraft und die trägen Auftriebskraft im gekrümmten Microchannel, große Partikel oder Neutrophilen (> 10 µm) befinden sich in den Kanal und kleine Partikel Schleim Aggregate und Trümmer kleiner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH/NIAID (R21AI119042) sowie NIH U24 Probe Sparing-Assay-Programm (U24-AI118656) unterstützt.
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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