Label-vrije neutrofiele verrijking van patiënt-afgeleide Airway secretie met behulp van Closed-loop Inertial Microfluidics
Summary
In dit onderzoek tonen we een label-vrije neutrofiele scheiding methode van klinische airway afscheidingen met kringloopsysteem bewerking van spiraal inertial microfluidics. De voorgestelde methode zou het uitbreiden van de klinische in vitro tests voor verschillende aandoeningen van de luchtwegen.
Abstract
Airway afscheidingen bevatten een groot aantal cellen van het immuunsysteem-gerelateerde, bijvoorbeeldneutrofiele granulocyten, macrofagen en lymfocyten, die kunnen worden gebruikt als een belangrijke bron om te evalueren van een verscheidenheid van longziekten, zowel voor onderzoek en klinische doeleinden. Vanwege de heterogene en viskeuze aard van patiënt slijm is er momenteel echter geen betrouwbare dissociatie-methode die de immune cellen van de gastheer in de patiënt airway afscheiding niet schaden. In dit onderzoek introduceren wij een monster-voorbereiding methode die inertial microfluidics voor de patiënt immuun beoordeling worden gebruikt. Ongeacht de heterogene fluidic eigenschappen van de klinische monsters, de voorgestelde methode herstelt meer dan 95% van de neutrofielen van airway secretie monsters die 1,000-fold zijn verdund met schone zoutoplossing milliliter. Door het opnieuw circuleren de geconcentreerde uitvoerstroom naar het oorspronkelijke monster reservoir, worden een hoge concentratie, herstel en zuiverheid van de immuuncellen verleend; recirculatie wordt beschouwd als een trade-off voor de single-run spuit gebaseerde werking van inertial microfluidics. De werking van het kringloopsysteem van spiraal microfluidics biedt leukocyten zonder fysieke of chemische verstoring, zoals blijkt uit de phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)-geïnduceerde elastase release van gesorteerde neutrofiele granulocyten.
Introduction
Aangezien cellen zijn ingekapseld in een grote hoeveelheid slijm in luchtwegen afscheidingen, werd de functionele beoordeling van leukocyten door een in vitro assay belemmerd. Dithiothreitol (DTT) is de meest voorkomende lysis-buffermengsel Meng het sputum cytologische analyse-en detectiemethoden voor bemiddelaars/mediators waarbij maximaal toelaatbare levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen1,2te distantiëren. Echter kan DTT interfereren met de oppervlakte-gebonden antigenen van airway neutrofielen, resulterend in de verstoring van neutrofiele functie zoals elastase en myeloperoxidase (MPO) release2,3. Daarom zijn enkele studies van menselijke airway neutrofiele functie uitgevoerd met perifeer bloed neutrofielen, die niet de fysiologische kenmerken van pulmonaire4 onthullen kunnen. Inertial microfluidics heeft intussen vooruitgang geboekt in het isoleren van de cellen van verschillende patiënten biomatrices5,6. Het evenwicht tussen inertial lift krachten en Dean Sleep Hiermee lijnt u de deeltjes/cel volgens hun grootte, die het mogelijk maakt van label-vrije deeltjes scheiding7. Onze fractie eerder introduceerde een monster voorbereiding methode voor circulerende tumor cellen8,9, ziekteverwekkers in bloed8, cellen van een schorsing cultuur10,11, 12, en polymorfonucleaire leukocyten (PMNs) van bloed13,14.
Hier introduceren we een protocol ter voorbereiding van immune cellen van een patiënt airway afscheidingen met behulp van gesloten-lus inertial microfluidics voor een stroomafwaarts in vitro assay, zoals de bepaling neutrophil elastase (NE). Deze methode biedt zowel hoge concentratie en nuttige toepassing, vooral wanneer er een aanzienlijke overlap in de laterale richting van de cel/deeltje waaruit de cel/deeltje-van-belang is om te worden verwijderd, die meestal in klinische monsters waargenomen wordt. Door het opnieuw circuleren van de binnenste muur (IW)-geconcentreerd grote deeltjes of cellen terug naar de input monsterbuisje, het deeltje of de cel-of-interest concentraten in het originele reservoir, terwijl achtergrond vloeistoffen met kleine mucin aggregaten het afval reservoir passeren. Ondanks de heterogene fluidic eigenschappen van klinische monsters, de voorgestelde methode herstelt consequent boven 95% van de neutrofielen van airway secretie monsters die 1,000-fold worden verdund met een schone zoutoplossing (~ 1 mL). Daarentegen, presenteert de lysis methode een breed scala van PMNs herstel tarieven afhankelijk van de conditie van de steekproef. Het voorgestelde protocol vangt leukocyten in een label-vrije manier met geen fysische of chemische ontwrichting, waarin de mogelijkheid om te oogsten van gevoelige cellen uit klinisch uitdagend biometrie met minimaal invasieve procedures.
Protocol
Representative Results
Discussion
In inertial microfluidics localiseren deeltje en cellen op een bepaalde laterale positie in een micro-kanaal op basis van hun grootte5,18,19,20. Als gevolg van het gecombineerde effect van de decaan Sleep kracht en de kracht van de traagheids lift in de gebogen microchannel, grote deeltjes of neutrofiele granulocyten (> 10 µm) bevinden zich in het kanaal en kleine deeltjes, slijm aggregaten en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door NIH/NIAID (R21AI119042) en NIH U24 monster Sparing assay programma (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
