تخصيب خالية من تسمية العَدلات من إفراز مجرى الهواء المستمدة من المريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي
Summary
في هذا البحث، نبدي طريقة فصل خالية من تسمية العَدلات من إفرازات السريرية مجرى الهواء باستخدام عملية مغلقة من دوامة القصور الذاتي ميكروفلويديكس. الطريقة المقترحة ستوسع فحوصات سريرية في المختبر لأمراض الجهاز التنفسي المختلفة.
Abstract
مجرى الهواء إفرازات تحتوي على عدد كبير من الخلايا المتصلة بجهاز المناعة، مثلاً، العَدلات، الضامة، والخلايا الليمفاوية، التي يمكن استخدامها كمورد رئيسي لتقييم مجموعة متنوعة من الأمراض الرئوية، سواء بالنسبة للبحوث والأغراض السريرية. ومع ذلك، نظراً للطبيعة غير المتجانسة ولزوجة المخاط المريض، يوجد حاليا أي أسلوب الانفصال الموثوق بها التي لا تضر بالخلايا المناعية المضيف في إفراز مجرى الهواء المريض. في هذا البحث، علينا الأخذ بأسلوب إعداد نموذج يستخدم ميكروفلويديكس القصور الذاتي للتقييم المناعي للمريض. بغض النظر عن خصائص العينات السريرية فلويديك غير المتجانسة، يستعيد الطريقة المقترحة أكثر من 95 في المائة العَدلات من عينات إفراز مجرى الهواء التي هي المخفف 1,000-fold مع ملليلتر من المحلول الملحي نظيفة. وترد بتعميم دفق الإخراج المركزة إلى خزان عينة أولية، تركيزات عالية والانتعاش والنقاء من الخلايا المناعية؛ ويعتبر إعادة تدوير مفاضلة لتشغيل المستندة إلى حقنه واحدة تديرها ميكروفلويديكس القصور الذاتي. وتقدم العملية حلقة مغلقة من دوامة ميكروفلويديكس الكريات البيضاء دون اضطراب الفيزيائية أو الكيميائية، كما يتبين من phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)-الناجم عن إطلاق سراح elastase العَدلات تم فرزها.
Introduction
حيث يتم تغليف الخلايا في كمية كبيرة من المخاط في مجرى الهواء إفرازات، وعرقل الوظيفية تقييم الكريات البيضاء بفحص في المختبر . ديثيوثريتول (DTT) هو الأكثر شيوعاً تحلل المخزن المؤقت أيوناتها وتجانسه البلغم لتحليل الخلوية والكشف عن الوسطاء مع توفير السلامة مقبولة للخلايا المعزولة1،2. ومع ذلك، القيمة يمكن أن تتداخل مع المستضدات السطحية زمنياً من العَدلات مجرى الهواء، أدى إلى تعطيل وظيفة العَدلات مثل الستسي وميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) الإصدار2،3. ولذلك، أجريت دراسات قليلة من وظيفة العَدلات مجرى الهواء البشرية مع العَدلات الدم المحيطية، التي قد لا تكشف عن الخصائص الفسيولوجية ل الرئة4. وفي الوقت نفسه، ميكروفلويديكس القصور الذاتي قد أحرزت تقدما في عزل الخلايا من مختلف بيوماتريسيس المريض5،6. التوازن بين القوى رفع القصور الذاتي واسحب عميد يحاذي الجسيمات/الخلية وفقا لحجمها، مما يسمح للجسيمات خالية من تسمية الفصل7. عرض مجموعتنا سابقا طريقة إعداد نموذج لتعميم ورم الخلايا8،9، العوامل الممرضة في الدم8خلايا من تعليق ثقافة10،11، 12، والكريات البيض النوى (بمنس) من الدم13،14.
نقدم لك هنا، وضع بروتوكول لإعداد الخلايا المناعية من إفرازات مجرى الهواء للمريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي للمتلقين للمعلومات في المختبر مقايسة، مثل المقايسة elastase العَدلات (شمال شرق). يوفر هذا الأسلوب التركيز العالي والانتعاش، ولا سيما عندما يكون هناك تداخل كبير في الاتجاه الأفقي الخلية/الجسيمات منه الخلية/الجسيمات من الفائدة المراد إزالتها، الذي يتم الاحتفال به عادة في العينات السريرية. بتعميم الجدار الداخلية (IW)-تركز الجزيئات الكبيرة أو الخلايا إلى أنبوب العينة الإدخال، والجسيمات أو مركزات الخلية من الفائدة في الخزان الأصلي، بينما يمر السوائل الخلفية مع المجاميع الصغيرة الميوسين خزان النفايات. على الرغم من خصائص العينات السريرية فلويديك غير المتجانسة، يسترد الأسلوب المقترح استمرار أعلاه 95% العَدلات من عينات إفراز مجرى الهواء التي هي تضعف 1,000-fold مع المحلول الملحي نظيفة (~ 1 مل). على النقيض من ذلك، يعرض طريقة تحلل طائفة واسعة من بمنس معدلات الاسترداد استناداً الشرط الذي عينة. يلتقط البروتوكول المقترح الكريات البيضاء بطريقة خالية من التسمية مع لا اضطراب الفيزيائية أو الكيميائية، التي توفر إمكانية لحصاد الخلايا الحساسة من تحدي سريرياً القياسات الحيوية مع إجراءات كسبها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في ميكروفلويديكس القصور الذاتي، تعريب الخلايا والجسيمات في موقف معين جانبية في الدقيقة-قناة استناداً على حجم5،18،،من1920. بسبب التأثير المشترك للعميد سحب قوة وقوة رفع القصور الذاتي في microchannel المنحنية أو الجسيمات الكبير?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/نييد (R21AI119042) فضلا عن برنامج الفحص “تجنيب عينة U24 المعاهد الوطنية للصحة” (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
