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Immunology and Infection

Variedad de glicanos impresos: Una técnica sensible para el análisis del repertorio de circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales

Published: February 14, 2019
doi:
10.3791/57662
, , , , , , , , , ,
1Infectious Pathology and Transplantation Division,Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh),Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department,Bellvitge University Hospital

Summary

Este trabajo muestra el potencial de la tecnología de glicanos impreso array (PGA) para el análisis de la circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales.

Abstract

El repertorio de anticuerpos anti-hidratos de carbono de un determinado individuo de circulación a menudo se asocia con su estado inmunológico. No sólo la condición inmune individual determina el éxito en la lucha contra las señales de amenaza potenciales internos y externos, sino también la existencia de un patrón particular de circulación de anticuerpos anti-glicanos (y su variación nivel serológico) podría ser un importante marcador de la aparición y progresión de determinadas condiciones patológicas. Aquí, describimos una metodología basada en impreso Glycan matriz PGA que ofrece la oportunidad de medir cientos de glicanos objetivos con muy alta sensibilidad; utilizando una cantidad mínima de muestra, que es un común animales presentes cuando pequeña restricción (ratas, ratones, hamster, etc.) se utilizan como modelos para abordar aspectos de enfermedades humanas. Como un ejemplo representativo de este enfoque, mostramos los resultados obtenidos en el análisis del repertorio de anticuerpos naturales anti-glicanos en ratones BALB/c. Demostramos que cada ratón BALB/c en el estudio, a pesar de ser genéticamente idéntica y mantenido en las mismas condiciones, desarrolla un patrón particular de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono. Este trabajo pretende ampliar el uso de la tecnología de la PGA para investigar repertorio (particularidades) y los niveles de circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono, tanto en la salud y durante cualquier condición patológica.

Introduction

Los anticuerpos desempeñan un papel central en nuestra defensa contra los invasores patógenos neutralizando directamente virus1,2 y bacterias2,3, activando el sistema del complemento4,5 y la mejora de la fagocitosis6. Además, son elementos esenciales en cáncer focalización y eliminación de las células malignas7y homeostasis mantenimiento8,9.

Trastornos del sistema inmune pueden resultar en enfermedades autoinmunes e inflamatorias cáncer de10 y11. Todas estas condiciones patológicas idealmente exigen un pronto diagnóstico para un tratamiento eficaz. En el caso de enfermedades autoinmunes, la presencia serológica de autoanticuerpos en la mayoría de los casos es un predictor para el diagnóstico de autoinmunidad10,12. Estos anticuerpos reaccionan con la superficie celular y extracelular autoantigens y, a menudo presentes durante muchos años antes de la presentación de enfermedad autoinmune10,12. Cáncer y deficiencias inmunes se diagnostican también con exámenes de sangre que sea medir el nivel de elementos inmunes como anticuerpos, o su actividad funcional11.

La identificación del repertorio de anticuerpos y sus niveles serológicos circulantes son fundamentales para establecer un pronóstico y evaluar la progresión de todas las condiciones patológicas. Previamente hemos demostrado el potencial de la técnica de la PGA para el análisis de la circulación de los anticuerpos en especies de animales13–16, minimizando el uso de grandes volúmenes de muestras serológicas, evitando el problema de asociada a anticuerpos de reactividad cruzada17 y perfiles de alto rendimiento que permite de un amplio repertorio de anticuerpos15.

Inmunoensayos basados en glicanos son principalmente condicionados, entre otros factores, por el origen y la producción de hidratos de carbono, que determinan la afinidad y Unión de ligandos15,18,19,20 ,21. Inmunoensayos basados en glicanos pueden ser desarrollados en suspensión (microesferas)15,21,22 , o en las superficies plana activado15,21,22, 23,24. Los últimos son ELISA (la más convencional de estos métodos) y PGA. No hay muchos datos que comparan estas metodologías en la misma configuración experimental15,25,26,27. Anteriormente hemos comparado la eficacia y la selectividad de estos inmunoensayos para anticuerpos anti-glicanos de perfil en las muestras de plasma humano individual15. Algunos anticuerpos como aquellos dirigidos a grupo de sangre anti-A/B, todos los inmunoensayos pueden detectar con significación estadística y correlacionó positivamente con los demás15,18,21. Mientras tanto, los anticuerpos anti-P1 se detectaron principalmente por PGA con mayor poder discriminativo y no había correlación en las determinaciones de los diferentes inmunoensayos basados en glycan15,18, 21. estas diferencias entre métodos se relaciona principalmente con el antígeno anticuerpo relación y glicanos orientación15. Arreglos de discos de ELISA y la suspensión son más susceptibles a Unión inespecífica que PGA porque hay un exceso de antígeno por anticuerpos en estos métodos15. Además, la orientación de glicanos en la PGA es más restringida que en arreglos de discos de ELISA y suspensión15. ELISA es conveniente cuando el estudio incluye un panel limitado de glicanos. Junto con arreglos de discos de suspensión, ELISA ofrece amplia flexibilidad con respecto a la reconfiguración de ensayo. PGA es excepcional conveniente para descubrimiento enfoques15,18,21,28. A pesar de estas claras ventajas y desventajas, los tres mencionados inmunoensayos podrían utilizarse para estudiar diferentes aspectos de las interacciones del anticuerpo-glicanos. El objetivo final del estudio es que guiará la selección de la metodología más adecuada.

El presente trabajo pretende ampliar el uso de la tecnología de la PGA para el análisis del repertorio de circulación de los anticuerpos anti-glicanos en pequeños animales. Como un resultado representativo, presentamos aquí un protocolo detallado para evaluar el repertorio de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono en ratones BALB/c adultos por PGA.

Protocol

1. Glycochips de producción Preparación de microarray Imprimir los glicanos (50 mM) y polisacáridos (10 μg/mL) en fosfato 300 mM solución salina tamponada (PBS, pH 8,5) en 6 repeticiones en portaobjetos de vidrio N-hydroxysuccinimide derivatizada, utilizando sin contacto arrayer robótica (gota volumen ~ 900 pL). Cada diapositiva contiene 4 bloques de sub conjuntos (figura 1A, en colores) repetidas 6 veces. Cada solo arreglo de discos secundario est…

Representative Results

Aquí, presentamos un resumen de resultados representativos obtenidos de la cuantificación del repertorio de anticuerpos naturales anti-glicanos en una población de ratones BALB/c 20. El glycochips utilizado en este estudio contenía 419 glycan diferentes estructuras. La mayoría glycans se sintetizaron como -CH2CH2CH2NH2 espaciador-armados O-glucósidos, en varios casos como -CH2CH2NH2 o – NHCOCH…

Discussion

Glycan microarrays se han convertido en herramientas indispensables para el estudio de las interacciones proteína-glicanos40. El presente trabajo describe un protocolo basado en la tecnología de la PGA para estudiar el repertorio de la circulación de anticuerpos anti-hidratos de carbono en ratones BALB/c. PGA ofrece la posibilidad a un gran número de pantalla de glycans biológico desconocido, es un descubrimiento excepcionalmente conveniente herramienta13,<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el “Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) otorgar PI13/01098 del Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de sanidad. DB-G resultó beneficiado desde una posición de investigación postdoctoral financiada por la Unión Europea séptimo programa marco (FP7/2007-2013) bajo 603049 de acuerdo de subvención (TRANSLINK). Trabajo de NK, NS y NB fue apoyado por beca #14-50-00131 de Fundación de la ciencia rusa. DB-G quiere expresar su agradecimiento a Marta Broto, J. Pablo Salvador y Ana Sanchis de excelente asistencia técnica y Alexander Rakitko para asistencia en el análisis estadístico. Con el apoyo de la “Pla de Doctorats industriales de la Secretaria d’Universitats i Recerca del Departament empresa i Coneixement de la Generalitat de Catalunya (número 2018 DI 021). Damos las gracias a programa de CERCA / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional.

Materials

Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).
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