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Immunology and Infection

印刷された糖鎖の配列: 小動物対策炭水化物抗体のレパートリーの分析のための高感度な技術

Published: February 14, 2019
doi:
10.3791/57662
, , , , , , , , , ,
1Infectious Pathology and Transplantation Division,Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh),Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department,Bellvitge University Hospital

Summary

この作品は、小動物の反炭水化物抗体の解析のための印刷された糖鎖アレイ (PGA) 技術の可能性を示しています。

Abstract

与えられた個々 の反炭水化物抗体のレパートリーはその免疫学的状態に関連付けられます。個々 の免疫状態は内部および外部の潜在的な脅威信号との闘いにおける成功を決定するだけでなく、循環抗糖鎖抗体 (とその血清学的変動) の特定のパターンの存在がありますが、発症と特定の病理学の条件の進行の重要なマーカーは。ここでは、非常に高い感度で糖鎖ターゲットの数百を測定する機会を提供する糖鎖アレイ PGA の印刷ベースの方法論について述べるサンプルは一般的な制限の場合小さな動物の最小限の量を使用 (ラット、マウス、ハムスター、等)、人間の病気の側面に対処するモデルとして使用されます。このアプローチの代表的な例として BALB/c マウスで自然の抗糖鎖抗体のレパートリーの解析から得られた結果を示す.各 BALB/c マウス遺伝的同一と同じ条件の下で維持されているにもかかわらず、研究に関与するが反炭水化物に対する自然抗体の特定のパターンを開発することを示す.この作品は、PGA レパートリー (特異性) を調査する技術の使用および反炭水化物抗体、健康と、病的な状態の間の両方のレベルを展開する主張します。

Introduction

抗体は直接活性化補体システム4,5ウイルス1,2と細菌2,3、中和することにより病原体の侵入に対して我々 の防衛で中心的な役割を再生します。貪食6の強化。また、彼らが癌と悪性細胞7および恒常性維持8,9の除去に不可欠な要素です。

免疫系の疾患は、自己免疫疾患および炎症性疾患10と癌11で起因できます。すべてのこれらの病理学の条件は理想的に効率的な治療のための迅速な診断を要求します。自己免疫疾患の場合は、ほとんどの場合の自己抗体の血清学的存在、自己免疫10,12の診断予測です。これらの抗体反応細胞表面と細胞外抗原と、彼らは、自己免疫疾患10,12のプレゼンテーションの前に多くの年のために存在。免疫不全と癌も診断される血液検査でどちらかが免疫抗体、または彼らの機能活動11などのレベルを測定します。

抗体とその血清学的レベルの循環のレパートリーの同定は、予後を設定し、前述の病理学の条件のすべての進行を評価する最優先されます。我々 は以前の血清サンプルの大量の使用を最小限に抑え、問題を回避するを PGA 動物種13–16、抗体の解析手法の可能性に示しています。抗体の交差反応性17と抗体15の豊富なレパートリーの可能高スループット プロファイルに関連付けられています。

糖鎖を用いたイムノアッセイが主に、他の要因によって調節起源と親和性と配位子15,18,19,20 のバインディングを決定する炭水化物の生産、21。懸濁液 (微粒子)15,21,22またはフラット アクティブ面15,21,22、糖鎖を用いたイムノアッセイを開発ことができます。 23,24。最後には、elisa 法 (これらのメソッドのほとんどの従来) と PGA が含まれます。同じ実験の設定15,25,26,27でこれらの方法を比較する多くのデータがないです。我々 は以前有効性と個々 のひと血漿サンプル15抗糖鎖抗体をプロファイルにこれらの免疫性を比較しています。それらターゲットの抗 A/B 血液型など、いくつかの抗体のためすべてのイムノアッセイ統計的有意性それらを検出可能性があります、彼らは積極的に15、18,21に互いに関連付け。一方、抗 P1 抗体は主に高い識別能力と PGA によって検出された、異なる糖鎖を用いたイムノアッセイ15,18,によって行われた決定に相関は認められなかった21. 方法のこれらの違い主に抗体/抗原の比と糖鎖の向き15に関連していた。ELISA および懸濁液の配列は、これらの方法15の抗体に対する抗原の超過があるので PGA より不明確な結合の影響を受けやすい。また、PGA の糖鎖の向きは ELISA とサスペンション アレイ15よりも制限されています。ELISA は、研究には糖鎖の限られたパネルが含まれている場合に便利です。サスペンション アレイ ELISA アッセイの再構成に関する広範な柔軟性を提供します。PGA は、発見のアプローチ15,18,21,28非常に便利です。にもかかわらず、これらの明確な長所と短所、糖鎖抗体の相互作用のさまざまな側面を研究する 3 つの述べられたイムノアッセイを使用できます。研究の最終目標は、1 つがより適切な手法の選択をご案内いたします。

現在目指している小動物の抗糖鎖抗体のレパートリーの分析のための PGA の技術の使用を拡張します。代表的な結果として提案はここで PGA で大人の BALB/c マウスで抗炭水化物に対する自然抗体のレパートリーを評価するために詳細なプロトコル

Protocol

1. Glycochips 生産 マイクロ アレイ作製 糖鎖 (50 mM) を印刷し、多糖類 (10 μ G/ml) 300 mM リン酸 6 でバッファリングされた生理食塩水 (PBS、pH 8.5) 複製を使用して、N ヒドロキシスクシンイミド誘導体のガラス スライド上に非接触ロボット arrayer (ドロップ ボリューム ~ 900 pL)。各スライドには、6 回繰り返されます (図 1 a色で) のサブ配列の 4 の異な?…

Representative Results

20 BALB/c マウスの人口の自然な抗糖鎖抗体のレパートリーの定量化から得られた代表的な結果の概要を紹介します。本研究で使用される glycochips には、419 の異なる糖鎖構造が含まれています。CH としてほとんどの糖鎖が合成された2チャンネル2チャンネル2NH2スペーサー武装O-CH2CH2NH2または – NHCOCH2N…

Discussion

糖鎖マイクロ アレイ40タンパク質糖鎖の相互作用を研究するための不可欠なツールとなっています。現在の仕事では、PGA BALB/c マウスにおける抗体の抗糖の循環のレパートリーを勉強する技術に基づくプロトコルについて説明します。PGA 画面多数不明な生物学的糖鎖の可能性を提供しています, ので、非常に便利な発見ツール13,15<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は「フォンド ・ デ ・研究 Sanitarias」によって支えられた (FIS) はカルロス III 健康研究所、スペイン保健省から PI13/01098 を付与。DB G だった欧州連合第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) 付与契約 603049 (TRANSLINK) の下で資金を供給されるポスドク研究の位置から寄与しました。NK、NS と NB の仕事はロシアの科学財団の補助金 #14-50-00131 によって支えられました。DB G は、統計分析の支援のためのアレキサンダー Rakitko と優れたテクニカル サポート アナ Sanchis J. パブロ サルバドール マルタ ブロトに感謝の意を表現したいです。支援を受けて、”Pla de Doctorats 工業デ ラ事務局 d’Universitats 私 Recerca デル Departament d’Empresa 私 Coneixement デ ラ ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ (数 2018 を許可・ ディ ・ 021)。我々 はセルサ プログラムに感謝/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ機関サポートのため。

Materials

Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
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Glycan ArrayAnti-carbohydrate AntibodiesSmall AnimalsSerumPrinted Glycan ArrayGlycan TargetsPolysaccharidesPBSN-hydroxy 6 Cinnamic Derivatized Glass SlidesBlocking BufferBufferMice SerumImmunoglobulin AggregationCentrifugationIncubation Chamber

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).
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