JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

Published: February 14, 2019
doi:
10.3791/57662
, , , , , , , , , ,
1Infectious Pathology and Transplantation Division,Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh),Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department,Bellvitge University Hospital

Summary

עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.

Abstract

הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות של אדם נתון קשורה לעיתים קרובות עם מעמדה אימונולוגי. לא רק תנאי המערכת החיסונית בודדים קובע את ההצלחה במאבק פנימי וחיצוני אותות איום פוטנציאלי, אלא גם קיומו של דפוס מסוים של מחזורי נוגדנים anti-glycan (וגם וריאציה רמת סרולוגית שלהם) יכול להיות סמן משמעותי של התפתחות, התקדמות של מצבים פתולוגיים מסוימים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מבוססת-מודפס Glycan מערך PGA מציעה את ההזדמנות כדי למדוד מאות מטרות glycan עם רגישות גבוהה מאוד; באמצעות כמות מזערית של מדגם, אשר בעלי חיים נוכח בעת קטנות הגבלת נפוצות (חולדות, עכברים, אוגר, וכו ‘) משמשים כמודלים להיבטים כתובת של מחלות אנושיות. דוגמה מייצגת של גישה זו, אנו מראים את התוצאות שהתקבלו הניתוח של הרפרטואר של נוגדנים אנטי טבעי-glycan בעכברים BALB/c. נדגים כי כל עכבר BALB/c מעורב במחקר, למרות להיות זהים גנטית ומתוחזק תחת באותם התנאים, מפתחת דפוס מסוים של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי. עבודה זו טוענת להרחיב את השימוש בטכנולוגיה PGA לחקור רפרטואר (specificities) ואת רמות ומגבלותיהם נוגדנים אנטי-פחמימות, בריאות והן במהלך כל מצב פתולוגי.

Introduction

נוגדנים לשחק תפקיד מרכזי בהגנה שלנו נגד פולשים גורמי מחלה על ידי ישירות לנטרל וירוסים1,2 ו חיידקים2,3, על ידי הפעלת המשלים מערכת4,5 השיפור של phagocytosis6. בנוסף, הם מרכיבים חיוניים סרטן מיקוד, חיסול של תאים ממאירים7, והומאוסטזיס תחזוקה8,9.

הפרעות של מערכת החיסון יכול לגרום מחלות אוטואימוניות דלקתיות10 וסרטן11. כל התנאים פתולוגיים אידיאלי דורשים אבחנה בקשה לטיפול יעיל. במקרה של הפרעות אוטואימוניות, נוכחות סרולוגית עצמיים ברוב המקרים הוא מנבא על אבחון של מחלת חיסון עצמי10,12. נוגדנים אלה מגיבים עם פני השטח של התא, autoantigens חוץ-תאית, והם לעיתים קרובות קיים במשך שנים רבות לפני המצגת של מחלות אוטואימוניות10,12. ליקויים החיסונית וסרטן מאובחנים גם עם בדיקות דם גם למדוד את רמת מרכיבי מערכת החיסון כגון נוגדנים, או שלהם פעילות פונקציונלית11.

הזיהוי של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים ורמות סרולוגית שלהם הם הכרחיים כדי לקבוע פרוגנוזה וכדי להעריך את ההתקדמות של כל התנאים שהוזכרו פתולוגי. בעבר הראו את הפוטנציאל של PGA טכניקת הניתוח של מחזורי נוגדנים מיני בעלי חיים שונים13–16, צמצום כמויות גדולות של דגימות סרולוגית, מתחמק מהבעיה הקשורים נוגדנים אשיג17 ו תפוקה גבוהה המאפשר פרופיל של רפרטואר נרחב של נוגדנים15.

מבוסס-Glycan immunoassays הם בעיקר מותנה, בין היתר, מקור וייצור של פחמימות, הקובעות את הזיקה ואיגוד של ליגנדים15,18,19,20 ,21. ניתן לפתח immunoassays Glycan מבוססי ההשעיה (microspheres)15,21,22 או משטחים מופעל שטוח15,21,22, 23,24. האחרון נמנים אליסה (המקובל ביותר של שיטות אלה) PGA. אין הרבה נתונים השוואת מתודולוגיות אלה אותה הגדרה ניסיוני15,25,26,27. בעבר השווינו את היעילות ואת מידת הבררנות של אלה immunoassays על פרופיל נוגדנים anti-glycan דוגמאות בודדות לפלסמה אנושית15. נוגדנים מסוימים כגון אלה מיקוד סוג הדם anti-A/B, כל immunoassays יכולה לזהות אותם עם מובהקות סטטיסטית, הם בקורלציה חיובית עם השני15,18,21. בינתיים, נוגדנים anti-P1 אותרו בעיקר על ידי PGA עם הכוח שמסווגת הגבוה ביותר, ולא היה שום קורלציה ב האישושים שנעשו על ידי15,immunoassays שונים מבוססי glycan18, 21. ההבדלים בין השיטות שהיו קשורים בעיקר אנטיגן נוגדן/יחס ואת glycan התמצאות15. אליסה ומתלים מערכים רגישים יותר מחייב לא ספציפי יותר PGA כי יש עודף של אנטיגן על נוגדנים אלה שיטות15. בנוסף, כיוון glycans ב PGA הוא מוגבל יותר מאשר מערכים של אליסה ומתלים –15. אליסה נוח כאשר המחקר כולל פאנל מוגבלת של glycans. מערכים ההשעיה, אליסה מציע גמישות רחבה יותר לגבי שינוי תצורה וזמינותו. PGA נוח במיוחד עבור גילוי גישות15,18,21,28. למרות ברור יתרונות וחסרונות אלה, immunoassays שהוזכרו שלוש יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של אינטראקציות glycan-נוגדן. המטרה הסופית של המחקר הוא שאחד ינחה את הבחירה של המתודולוגיה מתאימה יותר.

ההווה פועלים שואפת להרחיב את השימוש בטכנולוגיה PGA לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדני anti-glycan חיות קטנות. כתוצאה מכך נציג, אנו מציגים כאן פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הרפרטואר של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי בעכברים BALB/c למבוגרים מאת PGA.

Protocol

1. Glycochips ייצור הכנה Microarray הדפס את glycans (50 מ מ), ללא סוכרים (10 µg/mL) ב-300 מ מ פוספט תמיסת מלח במאגר (PBS, pH 8.5) ב-6 משכפל על גבי שקופיות זכוכית N-hydroxysuccinimide-derivatized, באמצעות מגע arrayer רובוטית (טיפה נפח ~ 900 pL). כל שקופית מכיל 4 בלוקים שונים של מערכי המשנה (איור 1A, בצבעים) 6 פעמ?…

Representative Results

כאן, אנו מציגים סיכום של תוצאות נציג המתקבל כימות של הרפרטואר של נוגדנים אנטי טבעי-glycan בקרב אוכלוסיה של 20 עכברים BALB/c. Glycochips השתמשו במחקר זה הכיל 419 מבנים glycan שונים. רוב glycans היו מסונתז כמו -CH2CH2CH2NH2 מרווח חמוש O-glycosides, בכמה מקרים כמו -CH2CH2</sub…

Discussion

מיקרו-מערכים Glycan הפכו להיות כלי הכרחי לימוד אינטראקציות חלבון-glycan40. העבודה הנוכחית מתאר פרוטוקול מבוסס על טכנולוגיית PGA ללמוד את הרפרטואר של מחזורי של נוגדנים אנטי-פחמימות בעכברים BALB/c. מאז PGA מציעה את האפשרות מסך לכמויות גדולות של glycans ביולוגית לא ידוע, זה גילוי נוח במיוחד כלי<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי “Fondo דה Investigaciones Sanitarias” (FIS) מענק PI13/01098 של קרלוס השלישי מכון בריאות, משרד הבריאות הספרדי. DB-G היה נהנו ממיקום מחקר פוסט דוקטורט במימון האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם 603049 (TRANSLINK). עבודתו של NK, NS, ו NB נתמך על ידי מענק #14-50-00131 של קרן המדע הרוסי. DB-G רוצה להביע את תודתי מרתה מתפוצץ, ג’יי פבלו סלבדור אנה Sanchis לסיוע טכני מעולה ושל אלכסנדר Rakitko לקבלת סיוע בניתוח סטטיסטי. עם התמיכה של “פלה דה Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats אני Recerca דל Departament d’Empresa אני Coneixement de la Generalitat דה קטלוניה (להעניק מספר 2018 DI 021). אנו מודים סרקא תכנית / Generalitat דה קטלוניה לתמיכה מוסדית.

Materials

Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway’s Immunobiology. , 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?. Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D’Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist’s opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., Varki, A. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. , 2015-2017 (2017).

Tags

Glycan ArrayAnti-carbohydrate AntibodiesSmall AnimalsSerumPrinted Glycan ArrayGlycan TargetsPolysaccharidesPBSN-hydroxy 6 Cinnamic Derivatized Glass SlidesBlocking BufferBufferMice SerumImmunoglobulin AggregationCentrifugationIncubation Chamber

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image