Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação
Summary
Este trabalho mostra o potencial da tecnologia de matriz (PGA) glicano impressa para a análise de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação.
Abstract
O repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono de um determinado indivíduo em circulação é frequentemente associado com seu estado imunológico. Não só a condição de imune individual determina o sucesso na luta contra os sinais de ameaça potencial interno e externo, mas também a existência de um determinado padrão de circulação de anticorpos antiglicano (e sua variação de nível serológica) poderia ser um marcador de significativa do aparecimento e progressão de certas condições patológicas. Aqui, descrevemos uma metodologia baseada em impresso glicano matriz PGA que oferece a oportunidade de medir centenas de glicano alvos com altíssima sensibilidade; usando uma quantidade mínima de amostra, que é um comum animais de presente quando pequena restrição (ratos, ratos, hamster, etc.) são usados como modelos para os aspectos de endereço de doenças humanas. Como um exemplo representativo desta abordagem, mostramos os resultados obtidos a partir da análise do repertório de anticorpos antiglicano natural em camundongos BALB/c. Demonstramos que cada rato BALB/c envolvido no estudo, apesar de ser geneticamente idêntico e mantida sob as mesmas condições, desenvolve um padrão específico de anticorpos anticarboidratos naturais. Este trabalho pretende expandir o uso da tecnologia de PGA para investigar o repertório (especificidades) e os níveis de anticorpos anti-hidratos de carbono, tanto na saúde e durante qualquer condição patológica em circulação.
Introduction
Os anticorpos desempenham um papel central em nossa defesa contra invasores patogénicos neutralizando diretamente vírus1,2 e bactérias2,3, ativando o sistema complemento4,5 e o reforço da fagocitose6. Além disso, eles são elementos essenciais no direcionamento de câncer e eliminação das células malignas7e homeostase manutenção8,9.
Distúrbios do sistema imunológico podem resultar em doenças auto-imunes e inflamatórias câncer de10 e11. Todas essas condições patológicas, idealmente, exigir um diagnóstico alerta para um tratamento eficiente. No caso de doenças auto-imunes, a presença serológica de auto-anticorpos na maioria dos casos é um predictor para diagnóstico de auto-imunidade10,12. Estes anticorpos reagem com a superfície da célula e extracelulares auto-antigénios e, muitas vezes estão presentes por muitos anos antes da apresentação da doença auto-imune10,12. Câncer e deficiências imunológicas também são diagnosticados com exames de sangue que quer medir o nível de elementos imunes, tais como anticorpos, ou sua atividade funcional11.
A identificação do repertório de anticorpos e seus níveis sorológicos de circulação são fundamentais para definir um prognóstico e avaliar a progressão de todas as mencionadas condições patológicas. Nós anteriormente demonstraram o potencial da técnica do PGA para a análise da circulação anticorpos em diferentes espécies animais13–16, minimizando o uso de grandes volumes de amostras serológicas, evitando o problema associados de reatividade cruzada de anticorpos17 e permitindo elevado-throughput de perfil de um extenso repertório de anticorpos15.
Baseado em glicano imunoensaios são principalmente condicionados, entre outros fatores, pela origem e produção de hidratos de carbono, que determinam a afinidade e ligação de ligantes15,18,19,20 ,21. Os imunoensaios baseados em glicano podem ser desenvolvidos em suspensão (microesferas)15,21,22 , ou em superfícies plana-ativado15,21,22, 23,24. Os últimos incluem o ELISA (o mais convencional desses métodos) e PGA. Não há muitos dados comparando estas metodologias na mesma configuração experimental15,25,26,27. Nós anteriormente compararam a eficácia e seletividade destes imunoensaios para anticorpos antiglicano de perfil em amostras de plasma humano individual15. Para alguns anticorpos como aqueles direcionamento anti-A/B Grupo de sangue, todos os imunoensaios podem detectá-los com significância estatística e eles positivamente correlacionaram com os outros15,18,21. Enquanto isso, os anticorpos anti-P1 foram detectados principalmente pela PGA com a mais alta potência discriminativa, e não houve correlação nas determinações feitas por diferentes baseados em glicano imunoensaios15,18, 21. estas diferenças entre os métodos foram principalmente relacionadas com o anticorpo/antigénio ratio e glicano orientação15. Matrizes de ELISA e suspensão são mais suscetíveis a vinculação inespecíficas que PGA, porque há um excesso de antígeno sobre anticorpos nestes métodos15. Além disso, a orientação dos glicanos em PGA é mais restrita do que em matrizes de ELISA e suspensão15. ELISA é conveniente quando o estudo inclui um painel limitado dos glicanos. Juntamente com matrizes de suspensão, ELISA oferece maior flexibilidade em relação a reconfiguração do ensaio. PGA é extremamente conveniente para descoberta abordagens15,18,21,28. Apesar destas claras vantagens e desvantagens, os três mencionados imunoensaios poderiam ser usados para estudar os diferentes aspectos das interações glicano-anticorpo. O objetivo final do estudo é o que guiará a seleção da metodologia mais adequada.
O presente trabalho tem como objetivo estender o uso da tecnologia de PGA para a análise do repertório de anticorpos antiglicano em pequenos animais em circulação. Como um resultado representativo, apresentamos aqui um protocolo detalhado para avaliar o repertório de anticorpos anticarboidratos naturais em adultos camundongos BALB/c pela PGA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microarrays de glicano tornaram-se ferramentas indispensáveis para o estudo de interações proteína-glicano40. O presente trabalho descreve um protocolo baseado em tecnologia de PGA para estudar o repertório da circulação de anticorpos anti-hidrato de carbono em camundongos BALB/c. Desde que o PGA oferece a possibilidade de um grande número de tela dos glicanos biologicamente desconhecidos, é uma descoberta extremamente conveniente ferramenta13,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela “Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) conceder PI13/01098 do Instituto de saúde Carlos III, Ministério espanhol da saúde. DB-G foi beneficiado de uma posição de investigação pós-doutoramento financiada pela União Europeia sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) sob o 603049 de acordo de Grant (TRANSLINK). Trabalho de NB e NK, NS, foi apoiado por grant #14-50-00131 da Fundação de ciência russo. DB-G quer expressar sua gratidão a Marta Broto, J. Pablo Salvador e Ana Sanchis assistência técnica excelente e Alexander Rakitko para auxílio na análise estatística. Com o apoio do “Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats eu Recerca del Departament d’Empresa eu Coneixement de la Generalitat de Catalunya (conceder número 2018 DI 021). Agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoio institucional.
Materials
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ | |
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