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Immunology and Infection

Tableau de Glycan imprimé : Une Technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation

Published: February 14, 2019
doi:
10.3791/57662
, , , , , , , , , ,
1Infectious Pathology and Transplantation Division,Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh),Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department,Bellvitge University Hospital

Summary

Ce travail montre le potentiel de la technologie de baies (PGA) de glycan imprimées pour l’analyse des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation.

Abstract

Le répertoire d’anticorps anti-hydrate de carbone d’un individu donné circulants est souvent associé à son statut immunologique. Non seulement l’état immunitaire individuel détermine le succès dans la lutte contre les signaux de menace potentiels internes et externes, mais aussi l’existence d’un modèle particulier consistant à diffuser des anticorps anti-glycane (et leur variation niveau sérologique) pourrait être un marqueur important de l’apparition et la progression de certaines conditions pathologiques. Nous décrivons ici une méthodologie axée sur l’imprimé glycane Array PGA qui offre la possibilité de mesurer des centaines de glycane cibles à très haute sensibilité ; à l’aide d’une quantité minimale de l’échantillon, qui est une restriction des animaux présents lors de petites commune (rats, souris, hamster, etc.) sont utilisés comme modèles pour portent sur des aspects des maladies humaines. Comme un exemple représentatif de cette approche, nous montrons les résultats obtenus par l’analyse du répertoire des anticorps naturels anti-glycanes chez des souris BALB/c. Nous démontrons que chaque souris BALB/c participent à l’étude, tout en étant génétiquement identique et entretenu dans les mêmes conditions, développe un modèle particulier des anticorps anti-glucides naturels. Ce travail se veut étendre l’utilisation de la technologie de la PGA pour enquêter sur le répertoire (spécificités) et les taux d’anticorps anti-hydrates de carbone, tant en santé au cours de n’importe quel état pathologique en circulation.

Introduction

Les anticorps jouent un rôle central dans notre défense contre l’invasion des agents pathogènes en neutralisant directement les virus1,2 et bactéries2,3, en activant le système de complément4,5 et l’amélioration de la phagocytose,6. En outre, ils sont des éléments essentiels en ciblant le cancer et l’élimination des cellules malignes7et homéostasie entretien8,9.

Troubles du système immunitaire peuvent provoquer des maladies auto-immunes et inflammatoires cancer et10 11. Toutes ces conditions pathologiques idéalement exigent un diagnostic rapide pour un traitement efficace. Dans le cas de maladies auto-immunes, la présence sérologique d’auto-anticorps dans la plupart des cas est un facteur prédictif pour le diagnostic de l’auto-immunité10,12. Ces anticorps réagissent avec la surface cellulaire et extracellulaire auto-antigènes et, ils sont souvent présentes pendant plusieurs années avant la présentation d’une maladie auto-immune10,12. Cancer et déficits immunitaires sont aussi diagnostiqués avec les analyses de sang que soit mesurer le niveau d’éléments immunitaires comme les anticorps ou leur activité11.

L’identification du répertoire des anticorps et leur niveau sérologique en circulation sont primordiales pour définir un pronostic et d’évaluer la progression de l’ensemble des conditions pathologiques mentionnées. Nous avons déjà démontré le potentiel de PGA technique pour l’analyse des anticorps dans différentes espèces animales13–16, circulants réduisant au minimum l’utilisation de grands volumes d’échantillons sérologiques, évitant le problème associés de réaction croisée des anticorps17 et profilage de haut débit permettant d’un vaste répertoire d’anticorps15.

Glycan immunologiques sont principalement conditionnées, entre autres facteurs, par l’origine et la production d’hydrates de carbone, qui déterminent l’affinité et la liaison des ligands15,18,19,20 ,21. Glycan immunologiques peuvent être développées en suspension (microsphères)15,21,22 ou en surfaces activées plat15,21,22, 23,24. Le dernier comprennent PGA et ELISA (le plus classique de ces méthodes). Il n’y a pas beaucoup de données comparant ces méthodologies dans le même cadre expérimental15,25,26,27. Précédemment, nous avons comparé l’efficacité et la sélectivité de ces tests immunologiques aux anticorps anti-glycane profil dans des échantillons de plasma humain individuel15. Pour certains anticorps comme ceux groupe ciblage de sang anti-A/B, tous les tests immunologiques pourraient détecter avec une signification statistique et ils en corrélation positive avec l’autre15,18,21. Pendant ce temps, des anticorps anti-P1 étaient principalement détectées par PGA le pouvoir discriminatif plus élevé, et il n’y avait pas de corrélation dans les décisions rendues par les différents immunologiques glycane15,18, 21. ces différences entre les méthodes étaient principalement liées à l’antigène/anticorps ratio et glycan orientation15. ELISA et suspension sont plus susceptibles à la liaison non-spécifique que PGA parce qu’il y a un excédent d’antigène anticorps dans ces méthodes15. En outre, l’orientation des glycanes dans la PGA est plus restreinte que l’ELISA et suspension de tableaux15. ELISA est commode quand l’étude inclut un panneau limité des glycanes. Ainsi que des baies de la suspension, ELISA offre une flexibilité plus large au sujet de la reconfiguration de l’essai. PGA est privilégiée pour la découverte des approches15,18,21,28. Malgré ces avantages et les inconvénients, les immuno-essais mentionnés trois pourraient servir à étudier les différents aspects des interactions anticorps-glycane. L’objectif final de l’étude est que celle guideront le choix de la méthodologie plus approprié.

Le présent travail vise à étendre l’utilisation de la technologie de la PGA pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glycanes chez de petits animaux en circulation. Comme un résultat représentatif, nous présentons ici un protocole détaillé afin d’évaluer le répertoire des anticorps anti-glucides naturels chez la souris BALB/c adulte par PGA.

Protocol

1. Glycochips Production Préparation de microarray Imprimer les glycanes (50 mM) et polysaccharides (10 µg/mL) dans une solution saline tamponnée (PBS, pH 8,5) à 6 réplique sur lames de verre N-hydroxysuccinimide-dérivatisés, utilisant le phosphate 300 mM sans-contact arrayer robotique (drop volume ~ 900 pL). Chaque diapositive contient 4 blocs de sous-tableaux (Figure 1 a, en couleurs) répétés 6 fois. Chaque sous-tableau unique est formé par …

Representative Results

Nous présentons ici un résumé des résultats représentatifs provenant de la quantification du répertoire d’anticorps naturels anti-glycanes chez une population de 20 souris BALB/c. La glycochips utilisée dans cette étude contenait 419 glycane différentes structures. La plupart des glycanes ont été synthétisés comme -CH2CH2CH2NH2 entretoise bras O-glycosides, dans plusieurs cas comme glycosides2NH2 ou …

Discussion

Glycan microarrays sont devenus des outils indispensables pour l’étude des interactions de protéine-glycane40. Les auteurs décrivent un protocole basé sur la technologie de la PGA pour étudier le répertoire consistant à diffuser des anticorps anti-glucides chez des souris BALB/c. Puisque PGA offre la possibilité à l’écran un grand nombre de glycanes biologiquement inconnu, c’est une découverte très pratique outil13,15<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par « Fondo de Investigaciones Sanitarias » (FIS) accorder PI13/01098 d’Institut de santé Carlos III, ministère espagnol de la santé. DB-G a bénéficié d’un poste de chercheur postdoctoral financé par l’Union européenne septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) en vertu de la subvention accord 603049 (TRANSLINK). Travail des NK, NS, NB a été soutenu par grant #14-50-00131 de fondation de la Science russe. DB-G veut exprimer sa gratitude à Marta Broto, J. Pablo Salvador et Ana Sanchis pour l’excellente assistance technique Alexander Rakitko d’assistance dans l’analyse statistique. Avec le soutien de la « Pla de Doctorats industriels de la Secretaria universitats i Recerca del Departament rotatif j’ai Coneixement de la Generalitat de Catalunya (octroyer le numéro 2018 DI 021). Nous remercions CERCA Programme / Generalitat de Catalunya d’appui institutionnel.

Materials

Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).
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