Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali
Summary
Questo lavoro Mostra le potenzialità della tecnologia array (PGA) glycan stampato per l’analisi degli anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali.
Abstract
Il repertorio di anticorpi anti-carboidrati di un dato individuo è spesso associato a sua condizione immunologica. Non solo la condizione immune individuale determina il successo nella lotta contro segnali di minaccia potenziale interne ed esterne, ma anche l’esistenza di un particolare modello di fare circolare gli anticorpi anti-glycan (e la loro variazione di livello sierologica) potrebbe essere un indicatore significativo dell’insorgenza e la progressione di alcune condizioni patologiche. Qui, descriviamo una metodologia basata su stampato Glycan Array PGA che offre l’opportunità di misurare centinaia di obiettivi glycan con sensibilità molto alta; utilizzando una quantità minima di campione, che è un comune restrizione presente quando piccoli animali (ratti, topi, criceto, ecc.) sono utilizzati come modelli per affrontare gli aspetti delle malattie umane. Come un esempio rappresentativo di questo approccio, vi indichiamo i risultati ottenuti dall’analisi del repertorio di anticorpi naturali anti-glycan nei topi BALB/c. Dimostriamo che ogni topo BALB/c coinvolto nello studio, pur essendo geneticamente identico e tenuta sotto le stesse condizioni, si sviluppa un modello particolare di anticorpi anti-carboidrati naturali. Questo lavoro sostiene di espandere l’uso della tecnologia di PGA per studiare il repertorio (specificità) ed i livelli di anticorpi anti-carboidrati, sia nella salute che durante qualsiasi condizione patologica.
Introduction
Gli anticorpi gioca un ruolo centrale nella nostra difesa contro agenti patogeni d’invasione neutralizzando direttamente virus1,2 e batteri2,3, attivando il complemento system4,5 e il potenziamento della fagocitosi6. Inoltre, essi sono elementi essenziali nel cancro di targeting e l’eliminazione delle cellule maligne7e omeostasi manutenzione8,9.
I disordini del sistema immunitario possono provocare1110 e cancro, malattie autoimmuni ed infiammatorie. Tutte queste condizioni patologiche richiedono idealmente una diagnosi rapida per un trattamento efficace. Nel caso di disordini autoimmuni, sierologica presenza di autoanticorpi nella maggior parte dei casi è un preannunciatore per sistema diagnostico di autoimmunità10,12. Questi anticorpi reagiscono con la superficie cellulare ed extracellulare autoantigeni e, sono spesso presenti per molti anni prima della presentazione di malattia autoimmune10,12. Cancro e deficit immunitari sono anche diagnosticati con esami del sangue che sia misurare il livello di sistema immunitario elementi quali gli anticorpi, o la loro attività funzionale11.
L’identificazione del repertorio di fare circolare gli anticorpi ed i loro livelli sierologici sono di primaria importanza per impostare una prognosi e valutare la progressione di tutte le citate condizioni patologiche. Precedentemente abbiamo dimostrato le potenzialità della tecnica di PGA per l’analisi degli anticorpi in diverse specie animali13–16, riducendo al minimo l’uso di grandi volumi di campioni sierologici, evitando il problema associato con gli anticorpi cross-reattività17 e profilatura di alto-rendimento consentendo di un vasto repertorio di anticorpi15.
Basato su glycan immunoassays principalmente sono condizionati, tra altri fattori, l’origine e la produzione di carboidrati, che determinano l’affinità e l’associazione di ligandi15,18,19,20 ,21. Basato su glycan test immunologici possono essere sviluppati in sospensione (microsfere)15,21,22 o in superfici piatto-attivato15,21,22, 23,24. L’ultimo includono ELISA (il più convenzionale di questi metodi) e PGA. Non c’è la quantità di dati confrontando queste metodologie la stessa impostazione sperimentale15,25,26,27. In precedenza abbiamo confrontato l’efficacia e la selettività di questi test immunodiagnostici per gli anticorpi anti-glycan profilo in campioni di plasma umano individuale15. Per alcuni anticorpi come quelli gruppo di sangue anti-A/B targeting, tutti i test immunologici potrebbero individuarli con significatività statistica e hanno correlato positivamente con la vicenda15,18,21. Nel frattempo, gli anticorpi anti-P1 principalmente sono stati rilevati da PGA con il più alto potere discriminante, e non c’era correlazione alle determinazioni fatta da diversi basati su glycan immunoassays15,18, 21. queste differenze tra metodi riguardavano principalmente l’antigene/anticorpo rapporto e glycan orientamento15. Le matrici di ELISA e sospensione sono più suscettibili di associazione aspecifici che PGA perché c’è un eccesso di antigene rispetto gli anticorpi in questi metodi15. Inoltre, l’orientamento dei glicani in PGA è più limitato rispetto a ELISA e sospensione matrici15. ELISA è comoda quando lo Studio include un pannello limitato di glicani. Insieme a matrici di sospensione, ELISA offre più ampia flessibilità per quanto riguarda la riconfigurazione di dosaggio. PGA è eccezionalmente conveniente per scoperta approcci15,18,21,28. Nonostante questi chiari vantaggi e svantaggi, i tre test immunologici accennati potrebbero essere utilizzati per studiare diversi aspetti delle interazioni glycan-anticorpo. L’obiettivo finale dello studio è che quello guiderà la selezione della metodologia più adatta.
Il presente lavoro si propone di estendere l’uso della tecnologia di PGA per l’analisi del repertorio di anticorpi anti-glycan nei piccoli animali. Come un risultato rappresentativo, presentiamo qui un protocollo dettagliato per valutare il repertorio di anticorpi anti-carboidrati naturali in topi BALB/c adulti di PGA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycan microarrays sono diventati strumenti indispensabili per lo studio di interazioni proteina-glycan40. Il presente lavoro descrive un protocollo basato su tecnologia di PGA per studiare il repertorio della circolazione di anticorpi anti-carboidrati nei topi BALB/c. Dal PGA offre la possibilità ad un gran numero di schermo di glicani biologicamente sconosciuto, è una scoperta eccezionalmente conveniente strumento13,15,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da “Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) concedere PI13/01098 da Carlos III Health Institute, Ministero della salute spagnolo. DB-G è stato beneficiato da una posizione di post-dottorato di ricerca finanziata dal Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto il 603049 di accordo Grant (TRANSLINK). Lavoro di NK, NS e NB è stato supportato da grant #14-50-00131 di russo Science Foundation. DB-G vuole esprimere la sua gratitudine a Marta Broto, J. Pablo Salvador e Ana Sanchis per l’eccellente assistenza tecnica e Alexander Rakitko per assistenza nell’analisi statistica. Con il supporto della “Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats ho Recerca del Departament aziendali ho Coneixement Gestio Guida de la Generalitat de Catalunya (grant numero 2018 DI 021). Ringraziamo CERCA programma / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale.
Materials
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ | |
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