JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Published: February 14, 2019
doi:
10.3791/57662
, , , , , , , , , ,
1Infectious Pathology and Transplantation Division,Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh),Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department,Bellvitge University Hospital

Summary

Bu eser basılı glycan dizi (PGA) teknoloji küçük hayvanlarda Anti-karbonhidrat antikorlar dolaşan analiz için potansiyelini gösterir.

Abstract

Anti-karbonhidrat antikorlar verilen bireyin dolaşan repertuar kez immünolojik durumu ile ilişkilidir. Sadece iç ve dış potansiyel tehlike sinyalleri mücadelede başarı bireysel bağışıklık durumu belirler, ama aynı zamanda anti-glycan antikorlar (ve onların serolojik düzey varyasyon) dolaşan belirli bir desene varlığı olabilir bir önemli nokta başlangıçlı ve patolojik belirli koşullar ilerleme. Burada, glycan hedefler yüzlerce ile çok yüksek duyarlılığı ölçmek için bir fırsat sunuyor Glycan dizi PGA baskılı tabanlı bir metodoloji açıklayan; ortak bir sınırlama mevcut küçük hayvanlar olan örnek, en az bir miktarda kullanarak (sıçanlar, fareler, hamster, vb) adresi yönleri insan hastalıkları ile model olarak kullanılır. Bu yaklaşım bir temsili örnek olarak, biz doğal anti-glycan antikorlar BALB/c farelerde repertuar analizinden elde edilen sonuçları göster. Biz her BALB/c fare olmanın genetik olarak aynı ve aynı koşullarda yapılmaktadır rağmen çalışma dahil belirli bir desene doğal anti-karbonhidrat antikor geliştirir göstermek. Bu eser repertuar (özelliklerine) araştırmak için PGA teknoloji kullanımı ve anti-karbonhidrat antikorlar, hem sağlık hem de herhangi bir patolojik durum sırasında dolaşan düzeylerini genişletmek iddia ediyor.

Introduction

Antikorlar merkezi bir rol özrüne patojenler doğrudan virüs1,2 ve bakteri2,3, Kompleman sistemi4,5 aktive ederek nötralize tarafından istila karşı oynamak ve fagositoz6geliştirme. Ayrıca, onlar kanser hedefleme ve kötü huylu hücreleri7ve homeostasis bakım8,9ortadan kaldırılması önemli unsurlardır.

Bozuklukları bağışıklık sisteminin otoimmün ve inflamatuar hastalıklar10 ve kanser11‘ neden olabilir. Bu patolojik koşullar ideal olarak komut istemi tanısı için etkili bir tedavi talep ediyorum. Otoimmün hastalıklar söz konusu olduğunda, serolojik otoantikorlar Olguların çoğunda tanı otoimmünite10,12için bir tahmin varlığıdır. Bu antikorlar ile hücre yüzeyine tepki ve hücre dışı autoantigens ve onlar uzun yıllar otoimmün hastalık10,12‘ sunum öncesi mevcut çoğu kez. Ayrıca bağışıklık eksiklikleri ve kanser kan testleri ile de antikorlar veya onların fonksiyonel etkinlik11gibi bağışıklık öğeleri düzeyini ölçmek tanısı vardır.

Dolaşan antikorları ve serolojik seviyelerine repertuar tanımlaması bir prognoz ve bahsedilen patolojik koşulların tümü ilerlemesini değerlendirmek için her şeyden. Daha önce sorun kaçınarak serolojik örnekleri, geniş hacimli tüketimini en aza PGA tekniği farklı hayvan türlerinin13–16, antikor dolaşan analiz için potansiyelini göstermiştir antikorları olan17 ve izin yüksek üretilen iş antikorlar15geniş bir repertuar profil oluşturma ile ilgili.

Glycan tabanlı uzun ağırlıklı olarak, diğer faktörler arasında kökeni ve üretim benzeşme ve bağlama ligandlar15,18,19,20 belirlemek karbonhidrat tarafından conditioned ,21. Glycan tabanlı uzun süspansiyon (mikroküreler)15,21,22 veya düz aktif yüzeyler15,21,22geliştirilebilir, 23,24. Son ELISA (en geleneksel yöntemlerin) ve PGA içerir. Fazla veri aynı deneysel ayarı15,25,26,27‘ deki bu metodolojileri karşılaştırma değil. Biz daha önce etkinlik ve bu uzun profil anti-glycan antikorlar bireysel insan plazma örnekleri15için selectivity karşılaştırıldığında var. Bu hedefleme anti-A/B kan grubu gibi bazı karşı antikorlar, tüm uzun onları istatistiksel anlamlılık ile tespit olabilir ve onlar olumlu15,18,21birbirleri ile ilişkili. Bu arada, anti-P1 antikorlar öncelikle en yüksek discriminative gücü ile PGA tarafından tespit edildi ve hiçbir bağlantı içinde farklı glycan tabanlı uzun15,18tarafından, yapılan tespitler yapıldı. 21. bu farklılıklar yöntemleri arasında ağırlıklı olarak antikor/antijen oranı ve glycan yönlendirme15için ilgili olduğunu. Çünkü aşırı antijen antikorlar bu yöntemleri15üzerinden ELISA ve süspansiyon diziler PGA belirsiz bağlama duyarlı vardır. Buna ek olarak, glukanlardir PGA içinde yönünü ELISA ve süspansiyon diziler15‘ te daha daha olamaz. Çalışma glukanlardir sınırlı bir panel içerdiğinde ELISA uygun olur. Süspansiyon dizileri ile birlikte, ELISA tahlil yeniden yapılandırılması ile ilgili daha geniş esneklik sunar. PGA keşif yaklaşımlar15,18,21,28için son derece uygundur. Bu açık avantajları ve dezavantajları rağmen üç belirtilen uzun glycan-antikor etkileşimleri farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir. Son çalışma bir daha uygun yöntemleri yelpazesi rehberlik edecek hedeftir.

Mevcut iş PGA teknoloji kullanımı küçük hayvanlarda anti-glycan antikorlar dolaşan repertuar analizi için genişletmek amaçlamaktadır. Temsil edici bir sonuç olarak, burada doğal anti-karbonhidrat antikorlar PGA tarafından yetişkin BALB/c farelerde repertuar değerlendirmek için detaylı bir protokol mevcut.

Protocol

1. Glycochips üretim Mikrodizi hazırlık Glukanlardir (50 mM) baskı ve polisakkaritler (10 µg/mL) 300 mM fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 8,5) 6 çoğaltır kullanarak N-hydroxysuccinimide-derivatized cam slaytlar temassız robotik arrayer (damla birim ~ 900 pL). Her slayt 6 kez tekrar 4 farklı blok alt diziler (Şekil 1A, renklerde) içerir. Her tek alt dizi (8 × 14 sütun satırda) denetimleri de dahil olmak üzere 112 farklı glycan nokt…

Representative Results

Burada, doğal anti-glycan antikorlar 20 BALB/c farelerin bir popülasyondaki repertuar miktar elde edilen temsilcisi sonuçlarının özetini mevcut. Bu çalışmada kullanılan glycochips 419 farklı glycan yapılar içermektedir. Çoğu glukanlardir -CH sentezlenmiş2CH2CH2NH2 spacer Osilahlı-glikosidler, çeşitli durumlarda -CH2CH2NH2 veya NHCOCH -2NH2 glikosidler olarak. Tüm…

Discussion

Glycan microarrays protein-glycan etkileşimleri40eğitim için vazgeçilmez araçlar haline gelmiştir. Mevcut çalışma BALB/c farelerde Anti-karbonhidrat antikorların dolaşan repertuar çalışmaya PGA teknolojisi tabanlı bir protokol açıklar. PGA biyolojik olarak bilinmeyen glukanlardir ekran çok sayıda imkanı sunuyor, bir son derece uygun bulma aracı13,15,28oldu. Önerilen yöntem aynı Den…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser “Fondo de Investigaciones Sanitarias” tarafından desteklenmiştir (FIS) PI13/01098 Carlos III Sağlık Enstitüsü, İspanyol Sağlık Bakanlığı vermek. DB-G Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) hibe sözleşmesi 603049 (bağlantı) altında tarafından finanse edilen bir doktora sonrası araştırma konum yararlanmış. NK, NS ve NB çalışmalarını grant #14-50-00131 Rus Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. DB-G Marta Broto, J. Pablo Salvador ve mükemmel teknik destek için Ana Sanchis ve Alexander Rakitko yardım istatistiksel analiz için minnettarlığını ifade etmek istiyor. Desteği ile “Pla de Doctorats sanayi de la Secretaria d’Universitats ben Recerca del Departament d’Empresa ben Coneixement de la Generalitat de Catalunya (sayı 2018 vermek DI 021). Eğer programı teşekkür ediyoruz / Generalitat de Catalunya kurumsal destek için.

Materials

Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway’s Immunobiology. , 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?. Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D’Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist’s opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., Varki, A. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. , 2015-2017 (2017).

Tags

Glycan ArrayAnti-carbohydrate AntibodiesSmall AnimalsSerumPrinted Glycan ArrayGlycan TargetsPolysaccharidesPBSN-hydroxy 6 Cinnamic Derivatized Glass SlidesBlocking BufferBufferMice SerumImmunoglobulin AggregationCentrifugationIncubation Chamber

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image