真菌病原体経路の回復液法による脂質指数測定
Summary
ここでは、高スループット実験の培養細胞におけるトリアシルグリセ ロールのダイナミクスを調べるため脂質液滴 (LD インデックス) を取得するためのプロトコルについて述べる。LD インデックス アッセイは、BODIPY 493/503 を使用する簡単で信頼性の高い方法です。このアッセイでは、dispendious の脂質の抽出または顕微鏡による解析を必要はありません。
Abstract
記事は、トリアシルグリセ ロール (タグ) 脂肪滴 (LDs) での蓄積を決定する機密性の高いマイクロ プレート法は、LD のインデックス アッセイを実装する方法を示します。脂質の抽出なし LD のインデックスを取得します。豊富な成長または枯渇窒素メディアといったさまざまな条件下で高スループット実験で LDs 量を測定できます。メソッドは、出芽酵母の脂質液滴代謝を勉強する最初の時間の記述されていたとはいえ、それは正常に担子菌の経路に適用されました。興味深いことに、細胞の大規模な様々 な哺乳類細胞には、酵母からメソッドを適用ことができます LDs は真核細胞の系統保存されている細胞内小器官であるので。LD インデックスに基づいて液体蛍光回復アッセイ (LFR) 焼入条件の下で BODIPY 493/503 のホルムアルデヒド.と固定細胞の添加によるヨウ化カリウムは、蛍光クェンチャーとして使用されます。蛍光と光学密度斜面間の比率は、LD インデックスという名前です。斜面は、時に取得した直線から算出 BODIPY 600 の光学密度と蛍光サンプル添加に対する nm (外径600) のプロットします。最適なデータ品質は、相関係数の等しいまたは 0.9 (r ≥ 0.9) の上に反映されます。マイクロ プレートに実装できるよう、複数のサンプルを同時に読むことができます。BODIPY 493/503 は脂質液滴に脂溶性蛍光染料のパーティションなので、LDs を蓄積する細胞の多くの種類で使用できます。
Introduction
脂肪滴 (LDs) は、ユビキタス細胞内脂肪体中性脂質、主にタグとステロールのエステル (SE) のコアで構成されます。コアは、perilipin とジアシルグリセ ロール アシル転移酵素、アセチル coa カルボキシラーゼ アシル-CoA 合成酵素1などの中性脂質の合成に関与する酵素のようなタンパク質と相互作用するリン脂質の膜によって囲まれています。その挙動によるリン脂質膜にはも加水分解のタグと SE2トリアシルグリセ ロール リパーゼが含まれています。細胞型、生物によってストアド中性脂質はエネルギーを生成に使用することができます。 またはリン脂質とシグナル分子を合成します。酵母、他のカビ、LDs 変更減らされた窒素のアベイラビリティを中性脂質生産3,4 を増加するキーことを示す培地の窒素/炭素比の変化に対する応答の内容の ,5。酵母におけるタグの大量生産食品産業、バイオ燃料のソースとしてバイオ テクノロジーに潜在的な使用しています。いくつかのストアドの脂質にはオメガ 3 とオメガ 6、栄養と食事の重要性6,7,8,9,10のような多価不飽和脂肪酸の比率が高いが含まれています。,11. 哺乳動物細胞、ひと細胞を含むの LDs はタグとコレステロールをエステルにも含まれています。リン脂質単層対話酵母、LDs で説明されている蛋白質の相同性哺乳類と付加的な蛋白質、不在である perilipin酵母12で。1 つのリン脂質単分子膜とその関連付けられているタンパク質の役割は LDs の構造を安定させるために、細胞内小器官とミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソームと脂質交換のために主に、空胞として LDs の対話を許可する提案1314,。興味深いことに、ヒトでは、LDs は、2 型糖尿病、動脈硬化、肝炎、冠状心臓病、その数15,16,17 に増加があるなどの病態に関与すると表示されます。.ウイルスの種類によっては、粒子2,18,19を組み立てるためのプラットフォームとして LDs を使用します。
人間の病理とその潜在的なバイオ テクノロジーの LDs の影響のため LDs 形成の厳密な実験的決定は重要な作業です。この記事は蛍光 (LFR) BODIPY 493/503 の回復に基づく信頼性の高い試金を記述 (4、4 フッ素 1、3、5、7、8-pentamethyl-4-ボラ-3 a、4 a diaza-s indacene)、細胞の中性脂質の内容の相対的な値を取得します。このアッセイでは、中性脂質米国アルテリシジンなど酵母、菌、脂質抽出20.を必要とせず、哺乳類細胞の蓄積のダイナミクスに従うこと出芽酵母タンパク質ホスファターゼを識別するために最初に適用したし、に関与するキナーゼの脂質代謝調節。これが脂質の抽出やタンパク質精製21,22なし可能だった。LFR もマクロファージ23LDs 形成の力学を確立に使用されています。BODIPY 493/503 の使用では、ナイルの赤として他の染料は中性脂質いくつかの利点があります。BODIPY 493/503 は中性脂質に非常に特有、発光スペクトルが狭い共焦点顕微鏡によるサンプルを分析するとき、赤の蛍光タンパク質や水戸トラッカーのような染料からの信号の同時検出を促進します。残念ながら、BODIPY 493/503 は退色に敏感が、曝露光24時 antiquenching 試薬を使用して、このプロセスを避けることができます。
酵母細胞の LFR の試金を遂行する目的の栄養条件下で培養するし、因数が異なる時間に撤回されます。ホルムアルデヒド、ヶ月細胞を 4 ° C で保存するときの LDs の整合性を保持するとセルを固定する次に、他の固定方法は避けてください、彼らは LDs の24セル内の劣化につながるので、メタノールまたは冷アセトンを使用して特にそれら。LD インデックスを測定するには、ホルムアルデヒド固定セルは、定義された濃度の水で中断されます。BODIPY 493/503 KI、により蛍光体を含むソリューションに追加し、その蛍光の回復がある蛍光体がセルに入るし、Ld に関連付けます。細胞の濃度は 600 の光学濃度を測定することによって定量化の蛍光測定 (485 nm/510 nm) に付随、nm。各サンプルは同じにもホルムアルデヒド固定細胞懸濁液の後の 5 μ 因数を追加することによって 4 回を読み取られます。蛍光・吸光度の空白セルの加算の前に取得されます。測定の直線性を決定することにより、蛍光や吸光度データの品質評価: 場合 r < 0.9、データは破棄されます。R 値は、基本的に蛍光の強度は細胞濃度を上げるに線形応答を生成する必要がありますので重要です。細胞濃度が高すぎる場合は、直線性が失われます。LFR アッセイは、高スループット実験で所望の LD 表現型を選択する高速、シンプルで経済的メソッドを提供します。希望の条件を選択すると、BODIPY、セルに LDs のイメージを提供することで染色同じホルムアルデヒド固定セルを用いた共焦点顕微鏡による個々 のセルの LD の内容を学ぶことができます。自分のタグや SE のコンテンツ今さらに分析できる薄層クロマトグラフィーによる。
Protocol
Representative Results
Discussion
LFR はそれが正常に脂質代謝酵母およびそれ以降の勉強に初めて適用された法米国アルテリシジン20,21で実装されています。LD インデックスは、細胞に蓄積されたタグの絶対値を与えない、細胞の脂質含量の高速なアイデアを提供しています、2 つまたは複数の実験条件から LD インデックスを比較すると、データの解釈は簡単です。BODIP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品が助成金によって支えられたセルバンテス Politécnico ナシオナル事務局・ デ ・危惧 y Posgrado (IPN SIP 20170864) プログラム ・ デ ・ Apoyo Proyectos ・ デ ・危惧 e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-大学国立自治・ デ ・ メヒコ (UNAM) と y Consejo ナシオナル デ サイエンス テクノロジー (256520 GGS と CONACyT 254904 JPP)。カルースト ・ デ ・ アンパロ、Pesquisa はリオ ・ デ ・ ジャネイロ (FAPERJ Cientistas 行う nosso ポルトガル Estado: E 26/103.353/2011)。QFB おかげで我々。オスカー イバン ・ Luqueño Bocardo 図式的な概観のため。LDs の共焦点顕微鏡の貴重なヘルプありがとう博士ミゲル ・ タピア ・ ロドリゲス。我々 は、我々 は米国アルテリシジンの適応出芽酵母における技術の開発に彼の先駆的な仕事のため博士ブルーノ Bozaquel Morais を感謝したいです。
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
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