Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

Gotitas del lípido (LDs) son cuerpos de grasa intracelulares ubicuos compuesto por un núcleo de lípidos neutros, principalmente etiquetas y ésteres de esterol (SE). El núcleo está rodeado por una monocapa de fosfolípidos que interactúa con las proteínas como enzimas implicadas en la síntesis de lípidos neutros, como el diacilglicerol acil-transferasa, carboxylase del acetilo-CoA y acil-CoA sintasa¹perilipin. Debido a su comportamiento dinámico, la monocapa de fosfolípidos también contiene triacilglicerol lipasas que hidrolizan etiquetas y SE². Dependiendo del tipo de célula y organismo, almacenados lípidos neutros pueden utilizarse para generar energía y sintetizan fosfolípidos y moléculas de señalización. En levaduras y otros hongos, el contenido de LDs cambia en respuesta a variaciones en la relación nitrógeno/carbono en los medios de cultivo, lo que indica que la disponibilidad de nitrógeno disminuida podría ser la clave para aumentar la producción de lípidos neutros^{3,4 ,5}. La producción de grandes cantidades de etiquetas en la levadura tiene un uso potencial en la biotecnología como fuente de biocombustibles y en la industria alimentaria. Algunos lípidos almacenados contienen altas proporciones de ácidos grasos poli-insaturados, como omega 3 y omega 6, con importancia nutricional y dietética ^{6,7,8,9,10 , 11}. LDs de células de mamíferos, incluyendo células humanas, también contienen etiquetas y ésteres de colesterol. La monocapa de fosfolípidos interacciona con los mamíferos homólogos de las proteínas se describe en la levadura Sud y con una proteína adicional, perilipin, que está ausente en S. cerevisiae¹². Uno propuso el papel de la monocapa de fosfolípidos y las proteínas asociadas es estabilizar la estructura del LDs y permitir la interacción de LDs con organelos como mitocondrias, retículo endoplasmático, peroxisomas y vacuolas, principalmente para el intercambio de lípidos ^13,14. Curiosamente, en los seres humanos, LDs parecen intervenir en patologías como diabetes tipo 2, ateroesclerosis, esteatohepatitis, enfermedad coronaria, en el cual hay un aumento en su número ^15,16,17 . Algunos tipos de virus utilizan LDs como plataformas para ensamblar los viriones ^2,18,19.

Debido a las implicaciones de la Sud en patologías humanas y su potencial uso biotecnológico, la exacta determinación experimental de formación mormona es una tarea importante. Este artículo describe un ensayo confiable basado en la recuperación de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 1-difluoro-4, 3, 5, 7, 8-r:-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obtener un valor relativo del contenido de lípidos neutros en las células. Con este análisis, es posible seguir la dinámica de la acumulación de lípidos neutros en hongos como U. maydis y S. cerevisiaey también en células de mamífero, sin necesidad de extracción de lípidos ²⁰. El método fue aplicado por primera vez en S. cerevisiae para identificar las proteína fosfatasas y quinasas implicadas en la regulación del metabolismo de los lípidos. Esto fue posible sin la extracción o purificación de la proteína^21,22. LFR también se ha utilizado para establecer la dinámica de formación de LDs en macrófagos peritoneales²³. El uso de BODIPY 493/503 tiene algunas ventajas sobre otros tintes de lípido neutral como Nilo rojo. BODIPY 493/503 es altamente específico de lípidos neutros y tiene un espectro de emisión estrecho, facilitando la detección simultánea de señales de tintes como proteína fluorescente roja o Mito-tracker, cuando las muestras son analizadas por microscopia confocal. Por desgracia, BODIPY 493/503 es sensible al fotoblanqueo, pero este proceso puede evitarse mediante el uso de un reactivo de antiquenching durante la exposición a luz²⁴.

Para llevar a cabo el ensayo LFR en células de levadura, son cultivadas en las condiciones nutricionales deseadas y alícuotas son retiradas en diferentes momentos. A continuación, las células son fijadas con formaldehído, que preserva la integridad de LDs para meses cuando las células son almacenadas a 4 ° C. Otras técnicas de fijación deben evitarse, sobretodo las de metanol o acetona frío, puesto que conducen a la degradación de mormones dentro de las células²⁴. Para medir el índice de LD, formaldehído-fija las células se suspenden en agua para obtener una concentración definida. Luego, se añaden a una solución que contiene el fluoróforo BODIPY 493/503 apagada por KI, y cuando el fluoróforo entra en la célula y se asocia con la mormona, hay una recuperación de su fluorescencia. Concomitante a la medida de la fluorescencia (485 nm/510 nm), la concentración de células se cuantifica midiendo la densidad óptica a 600 nm. Cada muestra se lee cuatro veces añadiendo subsecuentes partes alícuotas de 5 μl de una suspensión celular de formaldehído-fija al mismo bien. Espacios en blanco de fluorescencia y absorbancia son adquiridos antes de la adición de las células. La calidad de los datos de absorbancia y la fluorescencia son evaluados mediante la determinación de la linealidad de las mediciones: si r < 0.9, los datos se descartan. El valor de r es importante porque básicamente la intensidad de la fluorescencia debe producir una respuesta lineal a las concentraciones de células cada vez mayor. Si la concentración de células es demasiado alta, la linealidad se pierde. El ensayo LFR proporciona un método rápido, sencillo y económico para seleccionar el fenotipo deseado de LD en experimentos de alto rendimiento. Después de seleccionar las condiciones deseadas, el contenido de LD de células individuales puede ser estudiado mediante microscopía confocal, usando el mismo formaldehído-fija las células teñidas con BODIPY, proporcionando una imagen de LDs en la célula. Sus etiquetas y el contenido SE pueden ahora más analizadas por cromatografía en capa fina.