تحديد الفهرس الدهن الانتعاش Fluorescence السائل في مسببات الأمراض الفطرية مايديس Ustilago
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول للحصول على فهرس الحبرية الدهن (فهرس LD) لدراسة ديناميات triacylglycerols في الخلايا المستزرعة في تجارب الفائق. تحليل مؤشر LD هو طريقة سهلة وموثوق بها أن يستخدم بوديبي 493/503. لا تحتاج هذا الإنزيم استخراج دهن ديسبينديوس أو التحليل المجهري.
Abstract
المقالة يوضح كيفية تنفيذ المقايسة مؤشر LD، الذي فحص ميكروسكوبية حساسة لتحديد تراكم triacylglycerols (العلامات) في قطيرات الدهن (LDs). يتم الحصول على مؤشر LD دون استخراج الدهن. أنها تسمح لقياس محتوى LDs في تجارب الفائق تحت ظروف مختلفة مثل النمو في الغنية أو النيتروجين استنفدت وسائل الإعلام. أن كانت الطريقة التي وصفت لأول مرة لدراسة الأيض الدهني الحبرية في Saccharomyces cerevisiae، أنه تم تطبيقها بنجاح على باسيديوميسيتي Ustilago مايديس. من المثير للاهتمام، ونظرا لقديسي الأيام الأخيرة هي العضيات فيلوجينيتيكالي المصانة في الخلايا حقيقية النواة، الطريقة التي يمكن تطبيقها على مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا، من الخميرة لخلايا الثدييات. فهرس LD يستند على مقايسة الانتعاش fluorescence السائل (الحراجة) من بوديبي 493/503 تحت شروط التبريد، بإضافة الخلايا الثابتة مع الفورمالدهيد. يتم استخدام اليود البوتاسيوم يحتوي الأسفار. النسبة بين الأسفار والمنحدرات الكثافة البصرية يسمى مؤشر دينار. يتم حساب المنحدرات من الخطوط المستقيمة التي تم الحصول عليها عند بوديبي الأسفار والكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) رسم مقابل إضافة نموذج. تنعكس جودة البيانات الأمثل بمعاملات الارتباط مساوية أو أعلى 0.9 (r ≥ 0.9). يمكن قراءة عينات متعددة في وقت واحد كما أنها يمكن أن تنفذ في ميكروسكوبية. ولما بوديبي 493/503 الفلورسنت محبتين صبغ تلك الأقسام إلى قطيرات الدهن، يمكن استخدامه في العديد من أنواع الخلايا التي تتراكم LDs.
Introduction
قطرات الدهن (LDs) في كل مكان هيئات الدهون داخل الخلايا تتكون من مجموعة أساسية الدهون محايدة، أساسا العلامات واسترات ستيرول (جنوب شرق). نواة محاطة باحادي الطبقة فوسفوليبيدات التي تتفاعل مع البروتينات مثل بيريليبين والأنزيمات المشاركة في تركيب الدهون محايدة، مثل diacylglycerol الأسيل-ترانسفيراز و carboxylase أسيتيل CoA اشيل synthase1. بسبب سلوكها الحيوي، أحادي الطبقة فسفوليبيد كما يحتوي على ليباسيس ترياسيلجليسيرول أن يتحلل العلامات و سراج الدين2. اعتماداً على نوع الخلية والكائن الحي، تخزين الدهون محايدة يمكن استخدامها لتوليد الطاقة، أو توليف فوسفوليبيدات وجزيئات إرسال الإشارات. في الخميرة والفطريات الأخرى، يتغير محتوى LDs في استجابة للتغيرات في نسبة الكربون/النيتروجين في ثقافة وسائل الإعلام، مشيراً إلى أن توافر النيتروجين انخفاض ربما تكون المفتاح لزيادة إنتاج المادة الدهنية محايدة3،4 ،5. وقد إنتاج كميات عالية من العلامات في الخميرة استخدام محتمل في مجال التكنولوجيا الأحيائية كمصدر للوقود الأحيائي وفي صناعة الأغذية. بعض الدهون المخزنة تحتوي على نسبة عالية من الأحماض الدهنية المشبعة، مثل أوميغا 3 وأوميغا 6، مع الأهمية التغذوية والغذائية 6،،من78،،من910 , 11-LDs لخلايا الثدييات، بما في ذلك الخلايا البشرية، تحتوي أيضا على العلامات واسترات الكوليسترول في الدم. أحادي الطبقة فسفوليبيد يتفاعل مع الثدييات مثلى من البروتينات الموصوفة في الخميرة LDs وبروتين إضافية، بيريليبين، وغائبة في سيريفيسيا س.12. اقترح أحد دور أحادي الطبقة فسفوليبيد والبروتينات المرتبطة به هو استقرار هيكل LDs والسماح بالتفاعل بين قديسي الأيام الأخيرة مع العضيات الميتوكوندريا، هيولى، بيروكسيسوميس، وفاكوليس، أساسا لتبادل المحتوى الدهني 13،14. من المثير للاهتمام، في البشر، وقديسي الأيام الأخيرة تظهر أن تشارك في أمراض مثل داء السكري من النوع 2، وتصلب الشرايين، steatohepatitis، وأمراض القلب التاجية، فيه هناك زيادة بعدد 15،16،17 . استخدام بعض أنواع الفيروسات LDs كمنابر لتجميع18، 2،فيريونس19.
بسبب الآثار المترتبة على دس في الأمراض البشرية واحتمال استخدام التكنولوجيا الحيوية، تصميم التجريبية الدقيقة لقديسي الأيام الأخيرة تشكيل مهمة هامة. توضح هذه المقالة مقايسة موثوق بها استناداً إلى انتعاش الأسفار (الحراجة) من بوديبي 493/503 (4، 4-ديفلورو-1، 3، 5، 7، 8–بينتاميثيل–4–بورا-3a, 4a-ديزا-s-إينداسيني)، للحصول قيمة نسبية لمحتوى الدهون محايدة في الخلايا. مع هذا التحليل، من الممكن تتبع ديناميات تراكم الدهون محايدة في الفطريات مثل مايديس U. S. cerevisiae، وأيضا في خلايا الثدييات، دون الحاجة ل استخراج الدهن 20. الأسلوب الذي طبق لأول مرة في S. cerevisiae لتحديد فوسفاتاسيس البروتين ومؤنزم تشارك في تنظيم استقلاب الدهون. وكان هذا ممكناً بدون استخراج الدهن أو البروتين تنقية21،22. كما تم استخدام إعادة إنشاء ديناميات تشكيل LDs في الضامة البريتوني23. الاستخدام من بوديبي 493/503 بعض مزايا أكثر من الأصباغ الدهنية محايدة أخرى “النيل الأحمر”. بوديبي 493/503 محددة للغاية للدهون محايدة وله طيف الانبعاث ضيقة، تيسير الكشف المتزامن إشارات من الأصباغ مثل البروتين الفلورسنت الأحمر أو ميتو-المقتفي، عندما يتم تحليل العينات بالفحص المجهري [كنفوكل]. ولسوء الحظ، بوديبي 493/503 الحساسة إلى فوتوبليتشينج، ولكن يمكن تجنب هذه العملية باستخدام كاشف أنتيكوينتشينج أثناء التعرض ل الضوء24.
للقيام بفحص الحراجة في خلايا الخميرة، هم مثقف تحت ظروف التغذية المطلوبة، ويتم سحب مختبرين في أوقات مختلفة. وبعد ذلك، الخلايا ثابتة مع فورمالدهايد، مما يحافظ على سلامة LDs لأشهر عندما يتم تخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية. تقنيات التثبيت الأخرى ينبغي تجنبها، خاصة تلك التي تستخدم الميثانول أو الأسيتون البارد، نظراً لأنها تؤدي إلى تدهور LDs داخل الخلايا24. لقياس مؤشر LD، يتم تعليق الخلايا فورمالدهايد–الثابتة في الماء للحصول على تركيز محدد. ثم، يتم إضافتها إلى محلول يحتوي على فلوروفوري بوديبي 493/503 مروي بأن كي، وعندما يدخل الخلية فلوروفوري وتأييداً قديسي الأيام الأخيرة، هناك انتعاش في الأسفار. الملازمة لقياس الفلورية (485 نانومتر nm/510)، تركيز الخلايا هو كمياً عن طريق قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر. تتم قراءة كل عينة أربع مرات بإضافة اللاحقة مختبرين ميليلتر 5 من تعليق خلية فورمالدهايد–ثابت لنفسه جيدا. يتم الحصول على فراغات للأسفار وامتصاص قبل إضافة الخلايا. نوعية الأسفار وامتصاص البيانات يتم تقييمها بواسطة تحديد الخطي القياسات: إذا صاد < 0.9, يتم تجاهل البيانات. قيمة r مهم لأنه أساسا كثافة الأسفار ينبغي أن ينتج رد خطي على التركيزات المتزايدة في الخلية. إذا كان تركيز خلية مرتفع جداً، يتم فقدان الخطي. والرزن الحراجة يوفر طريقة سريعة وبسيطة واقتصادية لتحديد النمط الظاهري LD المرجوة في تجارب الفائق. بعد تحديد الشروط المطلوبة، يمكن أن تدرس محتوى خلايا فردية LD [كنفوكل] مجهرية، باستخدام نفس الخلايا الثابتة فورمالدهايد ملطخة بوديبي، تقديم صورة لقديسي الأيام الأخيرة في الخلية. هذه العلامات ومحتوى سراج الدين يمكن الآن مواصلة تحليلها بطبقة رقيقة اللوني.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحراجة هو أسلوب رواية التي تم تطبيقها للمرة الأولى لدراسة الأيض الدهني في S. cerevisiae والإصدارات الأحدث بنجاح تنفيذها في الولايات المتحدة مايديس20،21. على الرغم من أن الفهرس LD لا يعطي قيمة مطلقة للعلامات المتراكمة في الخلايا، فإنه يقدم فكرة سريعة عن م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل منح معهد بحوث النظم الوطنية-أمانة y بوسجرادو (معهد البوليتكنيك الوطني-المسبار-20170864)، برنامج دعم أ ه المشاريع لبحوث التكنولوجيا Innovación (بابيت IN222117)-(جامعة المكسيك الوطنية المستقلة جامعة المكسيك الوطنية المستقلة)، و y Consejo ناسيونال دي العلوم التكنولوجيا (254904-جب مبرزين و 256520-GGS). Fundação de Amparo البحوث ريو دي جانيرو (فابري-سينتيستاس هل Estado نوسو: 26/103.353/2011 ه). ونحن بفضل QFB. أوسكار إيفان Luqueño بوكاردو على العرض التخطيطي. ونحن نشكر الدكتور ميغيل رودريغيز تابيا لمساعدة قيمة في الفحص المجهري [كنفوكل] لقديسي الأيام الأخيرة. ونود أن نشكر الدكتور برونو مورايس بوزاكال لعمله الرائد في تطوير هذه التقنية في S. cerevisiae التي نحن تكييفها الولايات المتحدة مايديس.
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
References
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
- Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
- Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
- Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
- Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
- Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
- Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
- Kolouchova, I., Mat’atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
- Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
- Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
- Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
- Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
- Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
- Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
- Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
- Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
- Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
- Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
- Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Holliday, R., King, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. , 575-595 (1974).
