Определение липидов индекс путем восстановления жидкого флуоресценции в грибкового патогена Пузырчатая Maydis

Липидного капель (LDs) являются повсеместно внутриклеточного жира тела состоит из ядра нейтральные липиды, главным образом Теги и эфиры стеринов (SE). Ядро окружен монослоя фосфолипидов, который взаимодействует с белками, как perilipin и ферментов, участвующих в синтезе нейтральные липиды, например диацилглицерол ацил трансферазы, ацетил-КоА carboxylase и дефицит ацил CoA синтазы¹. Из-за его динамическое поведение фосфолипидный монослоя также содержит триацилглицеринов липазы которые гидролизуют Теги и SE². В зависимости от типа клеток и организм хранимые нейтральные липиды могут использоваться для получения энергии, или синтезировать фосфолипидов и сигнальных молекул. Дрожжи и другие грибки, содержание LDs изменения в ответ на изменения в коэффициент азота/углерода в культуре средств массовой информации, указав, что наличие снижение азота может быть ключом к увеличению липидный нейтральными производства^{3,4 ,5}. Производство большое количество тегов в дрожжи имеет потенциального использования в биотехнологии как источника биотоплива и в пищевой промышленности. Некоторые хранимые липиды содержат высокие пропорции полиненасыщенных жирных кислот, как Омега 3 и Омега 6, с питания и диетических значение ^{6,,78,9,10 , 11}. LDs mammalian клеток, включая клетки человека, также содержат теги и эфиры холестерина. Фосфолипидный монослоя взаимодействует с млекопитающих гомологичных белков, описанных в дрожжи LDs и с дополнительного белка, perilipin, который отсутствует в S. cerevisiae¹². Один предложил, что роль для его связанного белков и фосфолипидов монослоя стабилизации структуры LDs и разрешить взаимодействие LDs с органеллы митохондрии, эндоплазматический ретикулум, пероксисомы и вакуоли, главным образом для липидного обмена ^13,14. Интересно, что в организме человека, LDs, как представляется, быть вовлечены в патологии как тип 2 диабета, атеросклероза, стеатогепатит и ишемической болезни сердца, в котором есть увеличение их числа в ^15,16,17 . Некоторые типы вирусов использовать LDs как платформы для сборки вирионы ^2,18,19.

Из-за последствий LDs в человеческой патологии и их потенциального использования биотехнологических точного экспериментального определения формирования LDs является важной задачей. Эта статья описывает надежного анализа на основе восстановления флюоресценция (LFR) BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-бора 3А, 4а диазафенантрена s-indacene), чтобы получить значение относительного содержания нейтральные липиды в клетках. С этот assay можно проследить динамику накопления нейтральные липиды в грибы как U. maydis и S. cerevisiae, а также в клетках млекопитающих, без необходимости извлечения липидов в ²⁰. Метод был применен для в первый раз в S. cerevisiae для идентификации белковых фосфатаз и киназы, участвующих в регуляции жирового обмена. Это стало возможным без экстракции липидов и белков очистки^21,22. LFR также использовался для создания динамики формирования LDs в перитонеальных макрофагов²³. Использование BODIPY 493/503 имеет некоторые преимущества над другими красителями нейтральных липидов как красный Нила. BODIPY 493/503 весьма специфичен для нейтральные липиды и имеет узкий спектр излучения, облегчения одновременного обнаружения сигналов от краски как красный флуоресцирующий белок или Mito трекер, когда анализируются образцы confocal микроскопии. К сожалению BODIPY 493/503 чувствителен к Фотообесцвечивание, но этот процесс можно избежать с помощью antiquenching реагента при воздействии света²⁴.

Для проведения пробирного LFR в дрожжевых клеток, они культивировали в желаемый питания условиях, и аликвоты снимаются в разное время. Далее клетки фиксируются с формальдегидом, который сохраняет целостность LDs для месяцев, когда клетки хранятся при 4 ° C. Другие методы фиксации следует избегать, особенно те, с использованием метанола или холодной ацетона, поскольку они ведут к деградации LDs внутри клетки²⁴. Для измерения индекса LD, формальдегида Исправлена клетки подвешены в воде для получения определенной концентрации. Затем они добавляются в раствор, содержащий Флюорофор BODIPY 493/503 закаленном KI, и когда Флюорофор входит в ячейку и связывает с LDs, является восстановление ее флуоресценции. Сопутствующих измерений флуоресценции (485 Нм/510 нм), концентрация клеток количественно измеряя оптическую плотность 600 Нм. Каждый образец читается в четыре раза, добавив последующие 5 мкл аликвоты формальдегида Исправлена клеток подвески к тому же хорошо. Бланки флуоресценции и поглощения приобретаются перед добавлением клеток. Качество флуоресценции и поглощения данные оцениваются путем определения линейность измерений: если r < 0.9, данные отбрасываются. Значение r имеет важное значение, потому что в основном интенсивность флуоресценции должен производить линейным откликом на увеличение концентрации клеток. Если клетки концентрация слишком высока, линейность теряется. LFR assay обеспечивает быстрый, простой и экономичный метод для выбора желаемого фенотип LD в высок объём экспериментов. После выбора желаемых условий, LD содержание отдельных ячеек может быть изучен конфокальная микроскопия, используя те же формальдегида Исправлена клетки окрашивали BODIPY, обеспечивая образ LDs в ячейке. Теги и их SE содержания могут теперь далее анализироваться хромотографией тонким слоем.