Lipides Index détermination par Fluorescence liquide de récupération dans le champignon pathogène Ustilago Maydis

Gouttelettes lipidiques (LDs) sont omniprésents corps gras intracellulaires, composés d’un noyau de lipides neutres, principalement des TAGs et des esters de stérol (SE). Le noyau est entouré d’une monocouche de phospholipides qui interagit avec les protéines comme perilipin et enzymes impliquées dans la synthèse de lipides neutres, tels que le diacylglycérol acyl-transférase, l’acétyl-CoA carboxylase et l’acyl-CoA synthase¹. En raison de son comportement dynamique, la monocouche de phospholipides contient également des triacylglycérol lipase qui hydrolysent les TAGs et SE². Selon le type de cellule et de l’organisme, lipides neutres stockées peuvent être utilisés pour produire de l’énergie, ou synthétisent des phospholipides et des molécules de signalisation. Chez les levures et autres champignons, le contenu du LDs change en réponse aux variations du rapport carbone/azote dans les milieux de culture, ce qui indique qu’une diminution d’azote disponible pourrait être la clé pour augmenter les lipides neutres production^{3,4 ,},⁵. La production de quantités élevées de TAGs dans la levure a une utilisation potentielle en biotechnologie comme source de biocarburants et de l’industrie alimentaire. Certains lipides stockés contiennent des proportions élevées d’acides gras polyinsaturés, comme les oméga 3 et oméga 6, avec importance nutritionnelle et alimentaire ^{6,7,8,9,10 , 11}. si des cellules de mammifères, y compris les cellules humaines, contiennent également des TAGs et des esters de cholestérol. La monocouche de phospholipides interagit avec les mammifères homologues des protéines décrites dans la levure LDs et avec une protéine additionnelle, perilipin, qui est absente dans le S. cerevisiae¹². On a proposé le rôle de la monocouche de phospholipides et ses protéines associées est pour stabiliser la structure de LDs et autoriser l’interaction du LDs avec organites comme les mitochondries, le réticulum endoplasmique, peroxysomes et vacuoles, principalement pour l’échange de lipides ^13,,¹⁴. Fait intéressant, chez les humains, LDs semblent être impliqués dans des pathologies comme le diabète de type 2, l’athérosclérose, stéato-hépatite et maladie coronarienne, dans lequel il y a une augmentation de leur nombre ^15,16,17 . Certains types de virus utilisent LDs comme plates-formes pour assembler les virions ^2,18,19.

En raison des implications des LDs dans des pathologies humaines et leur utilisation biotechnologique, l’exacte détermination expérimentale de la formation de LDs est une tâche importante. Cet article décrit un test fiable basé sur la récupération de la fluorescence (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentaméthyl-4-bora-3 a, 4 a-diaza-s-indacene), pour obtenir une valeur relative de la teneur en lipides neutres dans les cellules. Avec ce test, il est possible de suivre la dynamique de l’accumulation de lipides neutres chez les champignons comme U. maydis et S. cerevisiae, ainsi que dans les cellules de mammifères, sans besoin d’ extraction de lipides ²⁰. La méthode a été appliquée pour la première fois chez S. cerevisiae pour identifier les protéines phosphatases et kinases impliquées dans la régulation du métabolisme des lipides. Cela n’était possible sans extraction de lipides ou de purification de protéine^21,22. LFR a également servi à créer la dynamique de formation de LDs dans les macrophages péritonéaux²³. L’utilisation de BODIPY 493/503 a certains avantages par rapport aux autres colorants de lipides neutres comme du Nil rouge. BODIPY 493/503 est hautement spécifique de lipides neutres et a un spectre d’émission étroit, facilitant la détection simultanée de signaux de colorants comme protéine fluorescente rouge ou Mito-tracker, lorsque les échantillons sont analysés par microscopie confocale. Malheureusement, BODIPY 493/503 est sensible au photoblanchiment, mais ce processus peut être évité en utilisant un réactif antiquenching pendant l’exposition à la lumière de²⁴.

Pour exécuter le test LFR dans les cellules de levure, ils sont cultivés dans les conditions nutritionnelles souhaitées et parties aliquotes sont retirés à des moments différents. Ensuite, les cellules sont fixées avec du formaldéhyde, qui préserve l’intégrité du LDs pendant des mois quand les cellules sont stockés à 4 ° C. Autres techniques de fixation doivent être évités, surtout ceux à l’aide de méthanol ou l’acétone froid, puisqu’ils conduisent à la dégradation de LDs dans les cellules²⁴. Pour mesurer l’indice de LD, formaldéhyde-correction des cellules sont en suspension dans l’eau pour obtenir une concentration définie. Ensuite, ils sont ajoutés à une solution contenant le fluorophore BODIPY 493/503 piégée par KI, et lorsque le fluorophore pénètre dans la cellule et l’associe avec les LDs, il y a une reprise de la fluorescence. Concomitante à la mesure de la fluorescence (485 nm/510 nm), la concentration des cellules est quantifiée par la mesure de la densité optique à 600 nm. Chaque échantillon est lu quatre fois en ajoutant ultérieur 5 µL d’extraits d’une suspension de cellules de formaldéhyde-correction pour le même bien. Flans de fluorescence et d’absorbance sont acquises avant l’ajout de cellules. La qualité de la fluorescence et les données d’absorbance sont évaluées en déterminant la linéarité des mesures : si r < 0,9, les données sont ignorées. La valeur de r est importante, parce que fondamentalement, l’intensité de fluorescence doit produire une réponse linéaire à des concentrations croissantes de cellule. Si la concentration en cellules est trop élevée, la linéarité est perdue. Le dosage de la LFR fournit une méthode simple, rapide et économique pour sélectionner le phénotype LD souhaité dans les expériences de haut débit. Après avoir sélectionné les conditions souhaitées, le contenu de la LD de cellules individuelles peut être étudié en microscopie confocale, utilisant les mêmes cellules de formaldéhyde-correction teintés avec BODIPY, fournissant une image des LDs dans la cellule. Leurs balises et le contenu SE peuvent maintenant être davantage analysés par chromatographie sur couche mince.