Lipid-Index Bestimmung von flüssigen Fluoreszenz Erholung der pilzliche Erreger Ustilago Maydis

Lipid-Tröpfchen (LDs) sind allgegenwärtige intrazellulären Fett Körper, bestehend aus einem Kern von neutralen Lipiden, vor allem TAGs und Sterol Ester (SE). Der Kern ist umgeben von einer Monoschicht von Phospholipiden, die mit Proteinen wie Perilipin und Enzyme beteiligt an der Synthese von neutralen Lipiden, wie Diacylglycerol Acyl-Transferase, Acetyl-CoA Carboxylase und Acyl-CoA-Synthase-¹interagiert. Durch sein dynamisches Verhalten enthält die Phospholipid-Monolayer auch Triacylglycerol Lipasen, die TAGs und SE²Hydrolyseneigung. Je nach Zelltyp und Organismus gespeicherten neutralere Lipiden können verwendet werden, um Energie zu erzeugen, oder synthetisieren Phospholipide und Signalmoleküle. In Hefen und anderen Pilzen ändert den Inhalt des LDs in Reaktion auf eine sich ändernde Stickstoff/Kohlenstoff-Verhältnis in Kulturmedien, darauf hinweist, dass verminderte Stickstoffverfügbarkeit möglicherweise der Schlüssel zu neutral Lipid Produktion^{3,4 zu erhöhen ,5}. Die Produktion von hohen Mengen von TAGs in der Hefe hat eine mögliche Verwendung in der Biotechnologie als Quelle von Biokraftstoffen und in der Lebensmittelindustrie. Einige gespeicherte Lipide enthalten hohe Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Omega-3 und Omega-6, mit Ernährungs- und diätetische Bedeutung ^{6,7,8,9,10 , 11}. LDs von Säugerzellen, einschließlich der menschlichen Zellen enthalten auch TAGs und Cholesterin-Ester. Die Phospholipid-Monolayer interagiert mit den Säugetieren homologe Proteine, die in der Hefe LDs beschrieben und mit einem zusätzlichen Protein, Perilipin, der abwesend ist in S. Cerevisiae¹². Eine vorgeschlagene Rolle für die Phospholipid-Monolage und seiner damit verbundenen Proteine, die LDs-Struktur zu stabilisieren und damit die Interaktion von LDs mit Organellen als endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Peroxisomen und Vakuolen, vor allem für Lipid Austausch ^{ist 13,14}. Interessanterweise scheinen beim Menschen, LDs Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, Arteriosklerose, Steatohepatitis und koronare Herzkrankheit, in dem gibt es eine Zunahme der Zahl ^{15,16,17 beteiligt sein} . Einige Arten von Viren nutzen LDs als Plattformen zusammenzubauen Virionen ^2,18,19.

Aufgrund der Auswirkungen der lokalen Entwicklungsstrategie in menschliche Pathologien und deren biotechnologische Einsatzmöglichkeit ist die genaue experimentelle Bestimmung der LDs-Bildung eine wichtige Aufgabe. Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige Assays basierend auf die Erholung der Fluoreszenz (LFR) von BODIPY 493/503 (4, 4-Difluoro-1, 3, 5, 7, 8-Pentamethyl-4-Bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacene), um einen relativen Wert des Inhalts der neutrale Lipide in den Zellen zu bekommen. Mit diesem Test ist es möglich, die Dynamik der Anhäufung von neutralen Lipiden in Pilzen wie U. Maydis und S. Cerevisiae, und auch in Säugetierzellen, ohne die Notwendigkeit von Lipid-Extraktion ²⁰. folgen Die Methode angewendet wurde, zum ersten Mal in S. Cerevisiae zu identifizieren, die Protein-Phosphatasen und Kinasen beteiligt die Regulierung des Fettstoffwechsels. Dies war möglich ohne Lipid-Extraktion oder Protein Reinigung^21,22. LFR wurde auch verwendet, um die Dynamik der LDs-Formation im peritonealen Makrophagen²³zu etablieren. Die Verwendung von BODIPY 493/503 hat einige Vorteile gegenüber anderen neutral Lipid-Farbstoffe als Nil rot. BODIPY 493/503 ist hochspezifisch für neutrale Lipide und hat einen schmalen Emissionsspektrum erleichtern die simultane Detektion der Signale von Farbstoffen wie rot fluoreszierende Protein oder Mito-Tracker, wenn die Proben durch konfokale Mikroskopie analysiert werden. Leider BODIPY 493/503 ist empfindlich gegenüber Immunofluoreszenz, aber dieser Prozess kann mithilfe einer antiquenching Reagenz während der Exposition gegenüber Licht²⁴vermieden werden.

Zur Durchführung der LFR Assay in Hefezellen, sie sind unter den gewünschten Ernährungs-Bedingungen kultiviert und Aliquote sind zu unterschiedlichen Zeitpunkten zurückgezogen. Als nächstes werden Zellen mit Formaldehyd, fixiert, die die Integrität des LDs monatelang bewahrt wenn Zellen bei 4 ° c gelagert werden Ndere Fixierung sollte vermieden werden, vor allem diejenigen, die mit Methanol oder kaltem Aceton, da sie zum Abbau der LDs innerhalb der Zellen²⁴führen. Um den LD-Index zu messen, sind Formaldehyd-feste Zellen im Wasser zu einer definierten Konzentration ausgesetzt. Dann werden sie zu einer Lösung mit der Fluorophor BODIPY 493/503 abgeschreckt durch KI hinzugefügt, und wenn der Fluorophor die Zelle betritt und die LDs ordnet, gibt es eine Erholung der seine Fluoreszenz. Begleitende der Fluoreszenz-Messung (485 nm/510 nm), die Konzentration der Zellen wird quantifiziert durch die Messung der optischen Dichte bei 600 nm. Jede Probe wird viermal gelesen, indem nachfolgende 5 µL Aliquots Formaldehyd fixiert Zellsuspension zu gleich gut. Rohlinge von Fluoreszenz und Absorption sind vor der Zugabe von Zellen erworben. Die Qualität der Fluoreszenz und die Extinktion-Daten werden durch die Bestimmung der Linearität der Messungen ausgewertet: Wenn R < 0.9, Daten werden verworfen. Der R-Wert ist wichtig, weil im Grunde die Intensität der Fluoreszenz eine lineare Reaktion auf steigenden Zelle Konzentrationen produzieren sollte. Wenn die Zellkonzentration zu hoch ist, ist die Linearität verloren. Der LFR-Test bietet eine schnelle, einfache und wirtschaftliche Methode, um wählen die gewünschte LD-Phänotyp im Hochdurchsatz-Experimente. Nach der Auswahl der gewünschten Bedingungen, kann der LD-Inhalt der einzelnen Zellen durch konfokale Mikroskopie, Verwendung der gleichen Formaldehyd-feste Zellen befleckt mit BODIPY, bietet ein Bild von der Kirche Jesu Christi in der Zelle untersucht werden. Ihre TAGs und SE Inhalte können jetzt weiter durch Dünnschichtchromatographie analysiert werden.