Lipide Index bepaling door vloeibare fluorescentie herstel in de schimmel pathogeen Ustilago Maydis

Lipide druppels (LDs) zijn alomtegenwoordige intracellulaire vet organen bestaat uit een kern in neutrale lipiden, voornamelijk TAGs en plantensterolen esters (SE). De kern is omgeven door een monolayer van fosfolipiden die met eiwitten zoals perilipin en enzymen die betrokken zijn bij de synthese van neutrale lipiden, zoals de diacylglycerol acyl-transferase, acetyl-CoA carboxylase en acyl-CoA synthase^{1 samenwerkt}. Als gevolg van het dynamische gedrag bevat de fosfolipide enkelgelaagde ook triacylglycerol lipasen die gehydrolyseerd TAGs en SE². Afhankelijk van het celtype en organisme, opgeslagen neutrale lipiden kunnen worden gebruikt voor het genereren van energie, of synthetiseren fosfolipiden en signalering moleculen. In gist en andere schimmels, de inhoud van LDs verandert in reactie op variaties in de stikstof/koolstofverhouding in de cultuur-media, die aangeeft dat de beschikbaarheid van de verminderde stikstof de sleutel wellicht tot het verhogen van de neutrale lipide productie^{3,4 ,5}. De productie van grote hoeveelheden van TAGs in gist heeft een potentiële gebruik in biotechnologie als bron van biobrandstoffen en in de voedingsindustrie. Sommige opgeslagen lipiden bevatten hoge verhoudingen van meervoudig onverzadigde vetzuren zoals omega 3 en omega 6, met voeding en dieet belang ^{6,7,8,9,10 , 11}. LDs van zoogdiercellen, met inbegrip van menselijke cellen, ook TAGs en cholesterol esters daarvan bevatten. De fosfolipide enkelgelaagde interageert met de homologe zoogdieren van de eiwitten in de gist LDs beschreven, en een extra eiwit, perilipin, die afwezig is in S. cerevisiae¹². Een voorgestelde rol voor de fosfolipide enkelgelaagde en de bijbehorende eiwitten is te stabiliseren van de LDS-structuur en de interactie van LDs met organellen als mitochondriën, endoplasmatisch reticulum en peroxisomen vacuolen, voornamelijk voor lipide uitwisseling ^13,14. Interessant is dat bij de mens lijken LDs te worden betrokken bij aandoeningen zoals diabetes type 2, atherosclerose, steatohepatitis en coronaire hart-en vaatziekten, waarin sprake is van een toename van hun nummer ^15,16,17 . Sommige soorten virussen LDs gebruiken als platformen te monteren de virionen ^2,18,19.

Als gevolg van de gevolgen van de LDs in menselijke pathologieën en hun potentiële biotechnologische gebruik is de exacte experimentele bepaling van de formatie van de LDs een belangrijke taak. Dit artikel beschrijft een betrouwbare test gebaseerd op het herstel van de fluorescentie (LFR) van BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), om een relatieve waarde van de inhoud van neutrale lipiden in cellen. Met deze test is het mogelijk om te volgen de dynamiek van de accumulatie van neutrale lipiden in schimmels zoals U. maydis en S. cerevisiae, en ook in zoogdiercellen, zonder de noodzaak van lipide extractie ²⁰. De methode werd toegepast voor de eerste keer in S. cerevisiae te identificeren van het eiwit phosphatases en kinases betrokken bij de regulering van lipide metabolisme. Dit was mogelijk zonder lipide extractie of eiwit zuivering^21,22. LFR is ook gebruikt om de dynamiek van de LDS-formatie in peritoneale macrofagen²³. Het gebruik van BODIPY 493/503 heeft enkele voordelen ten opzichte van andere neutrale lipide kleurstoffen Nile rood. BODIPY 493/503 is zeer specifiek voor neutrale lipiden en heeft een smalle emissiespectrum, vergemakkelijken de simultane detectie van de signalen van kleurstoffen zoals rode fluorescerende eiwit of Mito-tracker, wanneer de monsters worden geanalyseerd door confocale microscopie. Helaas, BODIPY 493/503 is gevoelig voor photobleaching, maar dit proces kan worden vermeden door het gebruik van een antiquenching-reagens tijdens blootstelling aan licht²⁴.

Voor het uitvoeren van de bepaling van de LFR in gistcellen, ze zijn gekweekt onder de gewenste voeding voorwaarden en aliquots op verschillende tijdstippen zijn ingetrokken. Vervolgens worden cellen bevestigd met formaldehyde, die de integriteit van LDs behoudt maandenlang wanneer cellen worden opgeslagen bij 4 ° C. Andere technieken van fixatie moeten worden vermeden, vooral die met behulp van methanol of koude aceton, aangezien zij tot de afbraak van de LDs binnen de cellen^{24 leiden}. Voor het meten van de LD-index, zijn formaldehyde-vaste cellen opgehangen in water te verkrijgen van een bepaalde concentratie. Vervolgens worden deze toegevoegd aan een oplossing met de fluorophore BODIPY 493/503 uitgeblust door KI, en wanneer de fluorophore de cel invoert en aan de LDs koppelt, er is een herstel van de fluorescentie. Gelijktijdige op de fluorescentie-meting (485 nm/510 nm), de concentratie van cellen wordt gekwantificeerd door het meten van de extinctie op 600 nm. Elk monster wordt vier keer gelezen door latere 5 µL aliquots van een formaldehyde-vaste celsuspensie goed aan hetzelfde toe te voegen. Spaties van fluorescentie en absorptie zijn vóór de toevoeging van cellen verkregen. De kwaliteit van de fluorescentie en de extinctie gegevens worden geëvalueerd aan de hand van de lineariteit van de metingen: als r < 0.9, gegevens worden verwijderd. De r-waarde is belangrijk omdat in principe de intensiteit van de fluorescentie een lineaire respons aan toenemende concentraties van de cel produceren moet. Als de cel concentratie te hoog, is de lineariteit verloren. De assay LFR biedt een snelle, eenvoudige en goedkope methode om te selecteren van het gewenste fenotype LD in high-throughput experimenten. Na het selecteren van de gewenste voorwaarden, kan de inhoud van de LD van afzonderlijke cellen worden bestudeerd door confocale microscopie, met behulp van dezelfde formaldehyde-vaste cellen gekleurd met BODIPY, een afbeelding van de LDs in de cel. Hun TAGs en SE inhoud kunnen nu verder worden geanalyseerd door Dunnelaagchromatografie.