Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans
Summary
Здесь мы опишем простой протокол для быстро производить сотни нематоды роста СМИ агар, 96-луночных культуры пластин с последовательным числом Caenorhhabditis elegans за хорошо. Эти культуры являются полезными для фенотипического скрининг всего организмов. Мы сосредоточимся на использование этих культур экрана химических веществ для про долговечность эффектов.
Abstract
Caenorhabditis elegans является полезным организма для тестирования химического воздействия на физиологии. Весь организм малые молекулы экраны предлагают значительные преимущества для выявления биологически активных химических структур, которые могут изменить сложные фенотипов, таких, как продолжительность жизни. Описанные здесь — это простой протокол для производить сотни 96-луночных культуры пластин с довольно последовательную количество C. elegans в каждой скважине. Далее мы определили как использовать эти культуры экран тысячи химических веществ для воздействия на срок службы нематоду C. elegans. Этот протокол позволяет использовать температуры чувствительных штаммов стерильные, агар пластины условий и простых животных, обработка для облегчения быстрого и высокой пропускной способности производства синхронизированных животных культур для скрининга.
Introduction
Здесь Протокол описан который был разработан для высокой пропускной способности скрининга химических соединений для воздействия на Caenorhabditis elegans продолжительность жизни. Сам протокол легко адаптируется для других фенотипические экранов, включая исследования с использованием штаммов C. elegans репортер. Этот протокол был успешно использован для выявления роман биологически активные соединения, NP1 (нитрофенил пиперазина 1), что сильно продлевает срок жизни C. elegans через механизм диетическое ограничение. NP1 и характеристика его влияние на продолжительность жизни, включая описание генетического пути в игре, было ранее описано в других разделах1. Этот отчет также включает в себя описание результатов крупномасштабного осуществления экрана. Здесь мы описываем в гораздо более подробно методология и настройки экрана, который является масштабируемой для мелко – и крупномасштабных приложений.
Цель, которая привела к созданию протокола, описанные здесь было разработать C. elegans культуры платформу, что позволило для быстрого скрининга больших химических библиотек для Роман биологически активных соединений. Хотя химические экраны проведены до разработки этого протокола, это были главным образом мелких и/или кандидат типа подходы2,3. Действительно большинство экранов, выполнена в лаборатории на десятки соединений используются стресс сопротивления анализов, с хитами, проходят проверку для долголетия эффекты4. Вместо этого это исследование стремится напрямую экран для жизни эффекты. Удивительно к моменту проведения крупномасштабных химических экраны с C. elegansбыли несколько описаний в научной литературе. Действительно по сравнению с другими типами экранов5,6,7, крупномасштабные химического скрининга с помощью C. elegans представляется неполной занятости.
Там были два описания крупномасштабных химических экранов в C. elegans , которые были использованы в качестве основы для разработки такого подхода. Первым из них был элегантный исследование из Питера Роя лаборатории с использованием химических экранов для выявления соединений, которые могут повлиять на развитие животных. Затем последовали с вперед мутагенеза экрана, чтобы выявить генетические цели этих химических веществ8исследование. Протокол, описанные в этом исследовании используется 24-ну паштетов, который был просто непригодными для этого исследования конкретных потребностей (ограниченное количество химического вещества в библиотеке и ограниченные имеющиеся инкубатор пространства). Другое исследование было Майкл Petrascheck инновационных и амбициозных мелкомолекулярных экран для жизни, расширяя химических веществ9,10. Это исследование используется 384-ну пластины и жидких культур. Другой особенностью этого экрана было использование FUDR (5-fluorodeoxyuridine) химически подавляют производство потомства. После значительного рассмотрения протокола, описанные в этом исследовании химической стерилизации и жидких культур C. elegans были избежать.
Хотя FUDR широко используется в C. elegans жизни экспериментов, существуют опасения, что FUDR может вызвать непредвиденные лекарственных взаимодействий, или что FUDR сам может иметь некоторое влияние на продолжительность жизни. Недавно этот последний вопрос был утвержден, по крайней мере в некоторых концентрации и, в частности при 25 ° C11. Обойти проблему загрязнения потомства, C. elegans штамм TJ1060 было использовано, который затаивает два независимых температуры чувствительных мутации (spe-9 (hc88) rrf-3(b26)II), ликвидировать производство спермы и показали, чтобы быть полезным; для массовой культуры синхронных населения12. Этот штамм был полностью стерильной при 25 ° C, но будет производить потомство при культивированный на 15-20 ° C. В настоящем исследовании использованы обычные культуры условий, с червями, ползать на поверхности агара, как результаты, полученные с жидким культуры не всегда воспроизводимые с обычными агар пластинами. Хотя это явление полностью не поняты, было продемонстрировано, что черви культивировали в жидком реагировать DR (диетическое ограничение) по-разному чем червей, культивируемых на стандартные носители13,14. Поэтому вполне правдоподобным, что жидких сред может маскировать некоторые д-р mimetics, который в противном случае будут определяться с экрана.
Обосновавшись на условиях культуры агара, были рассмотрены различные варианты скоринга производительности скважин в этот assay. Хотя различные автоматизированные или изображений на основе анализов были доступны, они потребовали, приобретение и развертывание систем технически сложных устройств, большинство из которых были дорогими. При рассмотрении этих вариантов, необходимо сослаться на предыдущие экраны продолжительность жизни всех типов. В конечном счете это исследование используется скоринга метод адаптировано из лаборатории ли Сиу Sylvia весь геном RNAi экрана для жизни фенотипов15. В частности все жизни пластины были созданы таким же образом, но только негативный контроль осуществлялся. После того, как отрицательный контроль пластины были подтверждены рядом полной смертности, тест пластины были забиты вручную. В этом крупномасштабные экрана срабатываний были подтверждены повторное тестирование с свежеприготовленные химических веществ, с использованием что экземплярах повторяет первичного срабатываний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали простой метод для культивирования C. elegans в 96-луночных пластины. Мы опишем эти культуры для использования химического скрининга и продолжительность жизни анализов, но они могут быть использованы для многих видов анализов. Хотя несколько хорошо культуры условия для химического скрининга ранее сообщалось8, включая продолжительность жизни анализ10, assay, описанные здесь отличается несколькими способами. Продолжительность жизни описанных здесь использует 96-луночных пластины, опирается на стерильную мутантов (вместо химической стерилизации), использует условий культуры агара, использует простой жидкости, обработка для перемещения червей и вручную забил в конечной точке. Различные подходы, используемые в этот assay может быть помощь исследователи искали методы, которые включают эти условия фильтрации.
Важнейшими элементами настоящего протокола главным образом центр на качество плит производится для assay. Во-первых при принятии плит важно, что на поверхности агара бесплатно пузыри и другие несовершенства. Эти вариации на поверхности агара почти всегда приводят к роющих и потери скважины. Во-вторых этот протокол основывается на высыхания жидкости на хранение на этапах установки и наркотического опьянения. Важно, что эти жидкости полностью удаляются, но агар не стать высохли. Занимательно, похоже, что черви в скважинах, которые не являются полностью высушить (плавание в жидкости) живут дольше, чем надлежащим сушеные скважин, в то время как чрезмерное сушки пластин приводит к высыхания и растрескивания агар, что приводит к червей рыться и потери. Еще одним важным элементом настоящего Протокола является обеспечение стерильных условиях. Как с любой срок assay, есть много работы с установки плиты, и много возможностей и времени существуют для assay губит загрязнения урегулировать и расти на тарелках.
В то время как продолжительность жизни assay, описанные здесь полезен для проверки соединений в C. elegans, оно ограничивается частности генетических особенностей, как он полагается на Стерильные штамм температуры чувствительных (ts); Мы использовали TJ1060, который имеет высокий стерильности пенетрантностью. Это ограничивает для скрининга штаммов с помощью этого метода. Альтернативные подходы, включая пересечение ts стерильные мутации в желаемый фон или с помощью химической стерилизации. Мы не пытались химической стерилизации с этот assay, но оно должно быть возможным. Потенциальные препятствия включают в себя размещение стерилизатора на червей, на правильной стадии и в правильной дозе. Протокол, в описанный здесь использует жидкого мыла, что быстро, но как представляется, не эффективно распределять взрослых. Таким образом эти черви развивать на тарелках и поэтому должны рассматриваться с стерилизации химическим на тарелках. Определение оптимальной дозы и времени бы важное значение для успеха. Альтернативные стратегии включают в себя использование дозирования метод, который можно перемещать взрослых. В прошлом мы нашли, что машины для выявления и сортировки взрослых обычно гораздо медленнее, чем простой жидкости обработчики, которые могут обойтись однородной суспензии взвешенных личинки.
В общем мы используем этот метод быстро экран химических веществ и лечения для большое положительное влияние на продолжительность жизни. Метод особенно эффективен, когда используется с несколькими дозами, высокий реплицировать чисел и тщательный мониторинг негативных элементов управления, которые всегда поддерживали и перемежаются среди пластины теста. Позитивные элементы полезны также при разработке и осуществлении экраны, описанные в этой рукописи. Однако чтобы быть эффективным положительный, элемент управления необходимо будет достаточно мощным и/или высокую прочность. Когда экран была первоначально развернута, обладающих мощным и надежные соединения не может быть идентифицирован. В настоящее время есть много сообщений в литературе «старения» вероятными кандидатами для положительных элементов управления полезны в экраны, описанных здесь. Как описано в разделе экран кандидат секции ожидаемые результаты по этой рукописи и на рисунке 2 и в таблице 1, составные NP1 является эффективный положительный контроль для этого экрана. Мы обычно подтверждают положительные хиты из этих экранов с Стандартный срок анализов на 3 мм культуры пластин.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дипа Bhaumik, Аарон Миллер и Боб Хьюз для оказания технической помощи. Штаммы были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Мы благодарны Грузии леса и членов Литгоу, Kapahi и Melov лабораторий для полезных обсуждений. Л. был поддержан национальных институтов здравоохранения (НИЗ) обучения Грант T32 AG000266 и Эллисон медицинский фонд/Американской Федерации из старения после стипендий. Эта работа была поддержана грантом от BioAge Labs, Грант Ларри л Hillblom фонда, а также национальных институтов здравоохранения предоставляет UL1024917, поддерживая Междисциплинарный исследовательский консорциум по Geroscience и 1R01AG029631-01A1 для G.J.L.
Materials
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
