שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

1. הכנת מאגרי מרק ליברות להשתמש בגרגרים טרום מעורב (ראה טבלת חומרים) ופעל הפרוטוקול של היצרן עבור הכנה. צמיחה נמטודות מדיה (NGM) אגר לערבב 23 גרם של אגר, דור 3 של NaCl, 2.5 גר’ peptone מה נשארתי, ולהוסיף מים יונים אוטוקלב ל’ 0.972 וקריר לתת עד 60 ° צלזיוס, 25 מ של 1 מ’ אשלגן פוספט (KPO4) מאגר (pH 6.0), 1 מ”ל של 1 מ’ מגנזיום גופרתי (MgSO4) , 1 מ”ל של 1 מ’ סידן כלורי (2CaCl) ולאחר 1 מ”ל של 5 מ”ג/מ”ל כולסטרול (באתנול). פתרון תת-כלורי מערבבים 5 מיליליטר 5 מ’ KOH, 4 מ של נתרן תת-כלורי פתרון (6%), ויונים H2O כדי הנפח הכולל של 50 מ. S הבזליים מערבבים 5 g של NaCl, 1 g K2HPO4, 6 גר’2פו ח’4ומים מיוננים 1 ליטר, ואז אוטוקלב. 2. הכנת מרוכז e. coli (OP50) הערה: שלב זה מתרכזת 1 ליטר של פתרון רווי e. coli לתוך 25 מ של מאגר הבסיס S. לחסן מ ל LB בלוק מרק (שלב 1.1) עם מושבה בודדת של e. coli (זן OP50) ולאחר תקופת דגירה של 4-6 h ב 37 ° C עם טלטול (250 סל”ד). השתמש 0.1 מ”ל של פתרון זה לחסן 1 ליטר של LB בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל’. דגירה 1 ליטר המבחנות בן לילה (12-16 ג) ב 37 ° C עם טלטול (250 סל”ד). צנטריפוגה תרבויות לילה 1 ליטר בבקבוקי 500 מ ל צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 10,000 x g ו- 4 ° C הצניפה החיידקים, decant משם המדיה הנותרים. Resuspend צנפה ב 25 מ ל S הבזליים (שלב 1.4). חנות ב 4 º C. 3. הכנת NGM תרבות צלחות עבור לוחות תרבות המונים להשתמש בהם כדי לייצר מספר גדול של תולעים, לוותר על 30 מ של אגר NGM מותכת (60 ° C) (שלב 1.2) ב קבינט על גבי לוחות תרבות 10 ס מ עם מנגנון אוטומטי שחולק נוזלים או פיפטה סרולוגית זרימה שכבתית. מאפשרים לילה יבש. Pipet 2 מ של OP50 מרוכז על כל צלחת 10 ס מ, להתפשט לגמרי לכסות את המשטח אגר על ידי הטיה וסיבוב לצלחת, ואז אפשר צלחות להתייבש. חנות צלחות ב 4 ° C עד 2 שבועות. עבור תפוקה גבוהה assay תרבות לוחות בשימוש להקרנה, לנצל את מתקן 8 ערוץ אוטומטית כדי לוותר על 0.15 מ של אגר NGM מותכת לתוך כל טוב של צלחת טוב 96 בארון זרימה שכבתית. טיפול שימוש כדי להפוך בארות בטוח הם ללא בועות, כמו אלה יאפשרו ומחילות של תולעים תסכן את וזמינותו בבאר. מאפשרים לילה יבש. חנות צלחות ב 4 ° C עד 2 שבועות. 4. הכנת טמפרטורה רגיש (ts) סטרילי C. Elegans תרבויות המונית להתחיל תרבויות, ‘תולעת איסוף’ (פיפטה מזכוכית עם כבל הפלטינה מצורפת או תולעת מיוצרים לבחור) תחת מיקרוסקופ ויבתר, באמצעות העברת ביצים 20 (זן TJ1060: spe-9 (hc88) אני; rrf-3(b26)II) אל תרבות המונים plate(s) מוכן בשלב 3.1. לאחר מכן, דגירה הצלחות ב- 20 ° C ל-6 ימים (מאפשר יותר מאשר דור אחד של צמיחה, כמו אתה ממקד לאוסף צאצאים של ביצי 20 עברה). מבחינה ויזואלית לאשר נוכחות של מבוגרים gravid (ביצים נוכח הרחם) עם מיקרוסקופ ויבתר. לאסוף המבוגרים gravid על ידי מחלק 2-3 מ”ל של S הבזליים לצלחת באמצעות פיפטה של זכוכית. מערבולת הנוזל סביב הצלחת ביד, ואז לאסוף את הנוזל לתוך צינור 15 מ”ל באמצעות פיפטה של זכוכית. ספין דרך צינור (1,000 g x 1.5 דקות ב- 20 ° C) הצניפה תולעים, ואז וארוקן את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ ל פתרון תת-כלורי (שלב 1.3) בגדר תולעת, במהירות לנער את הצינורית ביד בכיוון מלמעלה למטה Incubate ס’ 5 למשך 5 דקות, רועדת כל 2.5 דקות. שוב, ספין דרך צינור (1,000 x גרם 1.5 דקות); בגדר צריך להיות חום-צהבהב. תשאף את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ ל תת-כלורי פתרון בגדר ביצה ומנערים נמרצות את הצינור. דגירה 1-3 דקות, עם רועדת פה ושם, תוך מעקב אחר המראה עם המיקרוסקופ ויבתר. מבחינה ויזואלית לאשר רק ביצים הם שנותרו, והמשך לשלב הבא. ספין דרך צינור (1,000 g x 1.5 דקות), וארוקן את תגובת שיקוע. בגדר להיות לבן עם אין צבע חום.הערה: לאחר הסרת פתרון תת-כלורי, זה קריטי להשתמש טכניקות סטרילי, מאגרים, מאז זיהום (חיידקים ופטריות, בפרט) יכול להרוס את הניסוי, לבזבז זמן יקר, ריאגנטים. מחקר זה משמש ארונית זרימה שכבתית מסוננים ועבר נוזלים באמצעות רק פיפטות סטרילי וטיפים. פתח הצינורות בתוך חלל סטרילי. לשטוף את צניפה 3 פעמים עם S הבזליים, מסתובב למטה (x 1000 גרם 1.5 דקות) וכ רפה בעברית משם את תגובת שיקוע בכל פעם. מחדש להשעות בגדר ביצה ב- 2-3 מ ל S הבזליים. . הביצים האלה עכשיו ניתן על פתח לילה במאגר כדי לאסוף L1 פגית (שלב 5). 5. מאינקובטור C. Elegans במאגר כדי לקבל סינכרונית תרבויות (בהכנת L1 זחל C. Elegans ) Decant את הביצה צניפה ואת מאגר לתוך צלחת פטרי זכוכית סטריליים עם כיסוי. שוטפים את הביצים הנותרות מהצינור לתוך תבשיל באמצעות פיפטה סרולוגית עם 2-3 מ”ל של S הבזליים. הוסף 5 מ של S הבסיס כדי להקל על הצפיפות, כשם זה עשוי לעודד הבקיעה, כמו אור רועד (20 סל ד עם מטרף מסלולית רקדנית בטן). דגירה בין לילה ב- 20 ° C, כדי שיהיה זמן הביצים לבקוע (16-24 שעות). כל הוולדות אעצור בשלב 1סנט זחל (L1) העדר מזון.הערה: אנקדוטלי מציינת כי ההכנות L1 טריים (16-36 שעות לאחר אוסף ביצי) לייצר באוכלוסיות ביותר סינכרונית של תולעים בוגרות. איסוף L1s בשפופרת 15 מ”ל עם פיפטה סרולוגית. ספין למטה L1s ומפרידה (1,000 g x 1.5 דקות), תשאף משם את תגובת שיקוע, וחזור עד L1s כל שנאסף מן הבקיעה צלחות, תוך השארת 10 מ”ל של S הבסיס עבור השלב הבא. ברכבת התחתית המכיל L1s micropipette החוצה 0.01 mL (מיד לאחר ערבוב), לוותר על זה אל unseeded (אין e. coli) NGM צלחת. לספור את מספר L1s על הצלחת. חזור על פי 10 ולקבל ממוצע עבור מספר L1s של כל aliquot. מצפים בדרך כלל, בין 1-3 L1s לכל µL (כאשר החל עם לוחית תרבות המונים 1 המכיל ביצים 20). לקבוע עם פיפטה סרולוגית הנפח של S הבזליים מחזיק את L1s. ואז לנחש עם המספר הממוצע נחושה של תולעים לכל 0.01 מ ל, להשיג בשלב הקודם, כדי להעריך את המספר הכולל של L1s. באופן כללי, מצפה בין 10,000-30,000 L1s (לכל צלחת תרבות המונים המכילים ביצים 20). כדי להשתמש תרבות זו assay 96-ובכן, לדלל את המתלים L1 ל-1 L1 לכל µL בבקבוק מדיה עגול סטרילי, ולאחר מכן המשך לשלב 7. אם תרבות זו היא לשמש ליצירת נוספים C. elegans המונית, תרבויות ולאחר מכן המשך לשלב 6. 6. הכנה תרבות סינכרונית בקנה מידה גדול הערה: L1 פתרונות יכול לשמש כדי להגדיל במהירות את התולעת אוכלוסיות. ליצירת מספרים גדולים תולעת עם פתרון L1, לוותר על L1s עד 5,000 על כל אחד מספר צלחות תרבות המונים הרצוי. לאסוף מבוגרים gravid 2.5 ימים מאוחר יותר (20 ° C) כמתואר בצעדים 4.1-2, והמשך לשלב 4.3 כדי לאסוף את הביצים. כמו זה anecdotally נצפתה זה חוזר על עצמו אוסף תת-כלורי יכול להדגיש את האוכלוסייה המשועבדת, לפצל את האוכלוסיות על ידי איסוף ביצים עבור הפצת לפני העמדת האוכלוסייה שנותרה לטיפולים תת-כלורי, אז זה מספר דורות של האוכלוסייה לא נחשפים שוב ושוב לטיפול פתרון תת-כלורי. 7. התקנה של צלחות Assay 96-ובכן לאפשר את הצלחות assay (להכין בשלב 3.3) לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בזרימה שכבתית cabinet, להוסיף 5 µL של OP50 מרוכז (להכין בשלב 2.2) כל טוב. כמו קודם, השתמש מתקן אוטומטית של ערוץ 8. להוסיף 10 µL של השעיה L1 מכל קידוח באמצעות מתקן אוטומטית של ערוץ 8. זה תניב על ממוצע 10 תולעים לכל טוב, מכיוון שהן ההשעיה נוכח 1 L1 לכל µL. לקדם חלוקה שוויונית של L1s מ slurry, לוותר על L1s מבקבוק מדיה עגול באופן פעיל מעורב בינוני באיטיות והופך מערבבים בר. מכסים עם מכסה, תיבת אצוות של צלחות, צלחת, דגירה 25 ° c במשך יומיים. 8. טיפול 1 סנט יום למבוגרים C. elegans עם כימיקלים להסיר את הלוחות ספריית כימי מהמקפיא, ולאפשר צלחות לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך.הערה: צלחות ספריית כימי כפי שמתואר כאן לוחיות 96 טוב המכיל תרכובות דיסקרטית בכל טוב, כל אשר נמצאים ריכוז זהה של מומס דימתיל סולפוקסיד. ספריות אלה לא לנצל את העמודות החיצוני, אז כל צלחת יש מקסימום של 80 כימיקלים שונים. ב פרוטוקול המתוארים כאן, הריכוז הספרייה הוא 10 מ מ. חשוב לקחת בחשבון את ההשפעות ממס על פנוטיפים. ואילו מחקר זה מקרינים על ריכוז דימתיל סולפוקסיד של 0.5%, רמה זו אירעה חריגה לא מבחני תוחלת החיים האלה, מבחני תפוקה נמוכה, איפה זה נוטים יותר לקחת ריכוז פתרון מניות מתחם. פרוטוקול זה אינו עולה על 0.25%, אשר הוא רמה שבה תוחלת החיים שינויים לא יתרחשו16, לפחות המתח N2. בעדינות לנער צלחת ב rpm 60 על מטרף microplate עבור 1 דקות מיד לפני השימוש. משתמש אוטומטית נוזלי 96-ובכן הנדלר, העברת 0.75 µL של המתחם (דימתיל סולפוקסיד) מהצלחת ספריית לצלחת וזמינותו. עומק פיפטה במהלך הלידה נוזל לצלחת assay נשלטת בקפידה, כך קצות פיפטה המטפל נוזלי מעבירים את העוצמה 0.75 µL µL ~ 15 של נוזל על פני השטח של אגר (עם תולעים, OP50 מרוכז מצעדי 7.1 -2) לא לנקב פני השטח אגר בבאר. אל תשתמש ידני 8 או 12 פיפטות מרובה ערוצים חוץ במסכים קטנים מאוד (< 10 צלחות), כפי שהם יכולים להגדיל את שגיאה ולגרום לעיתים קרובות כתוצאה ניקב של פני השטח אגר, אשר פוגעת וזמינותו. הכינו צלחות של שליטה שלילי ספריית כימי עם דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), בהנחה הספרייה הנבדקת משתמשת דימתיל סולפוקסיד הממס. להפוך לוח בקרה שלילית 1 עבור כל 5 לבדוק הצלחות, עד 10 לוחות בקרה שלילית. במידת האפשר, גם לעשות צלחת בקרה חיובית (NP11 -20 מ מ, על ריכוז הסופית assay של 0.1 מ”מ, יעילה למטרה זו; ראה סעיף נציג תוצאות). לא להוסיף כימיקלים (מבחן או שליטה) 2 העמודות החיצוני של הלוחות, כפי שהם רגישים במיוחד לייבוש. 9. ייבוש תרבויות כדי להסיר את הנוזל מפני השטח של אגר, יבש הצלחות זרימה שכבתית ארון עבור 4-8 שעות. . זה קריטי כי הצלחות האלה הם יבשים לחלוטין אבל לא הופכים desiccated כמו כמה צלחות ייקח יותר זמן להתייבש יותר מאחרים, לפקח מקרוב את כל הצלחות ולהסיר ברגע שהם יבשים. לאשר ייבוש על ידי בדיקה חזותית זהיר הבארות בודדים של הצלחת.הערה: בהתאם גורמים, הכוללים את קצב הפליטה של הקבינט, הפעם שזה לוקח מדעית להיקבע. שלב הייבוש זה יכול לקחת כ- 4-8 h עבור ארון מלא. חותם צלחות עם סרט שקוף ולאחר מכן לשים את המכסים את הצלחת. לסובב את הצלחות 96-ובכן assay עבור 45 s-1,000 x g. חנות צלחות הפוכה ב 25 º C. 10. הבקיע את תרבויות C. Elegans לאריכות ימים לפקח על לוחות בקרה שלילית עד > 95% תמותה נצפית. בדוק לוחות שבועי עבור שתי שבועות ומדי יום לאחר מכן. Caenorhabditis גדודים של זן ו מינים אותו ניתן להציג לכלבים שונה באופן משמעותי על ידי משפט17.הערה: עבור וזמינותו תוחלת החיים המתוארים כאן, עם חיות TJ1060 תרבותי 25 ° c, 95% תמותה בקרב אוכלוסיות אלה שהתרחשה בין מבוגר יום 16-20. כאשר שליטה שלילי בארות נחשבים הגיעו > 95% מארק, ספין לאורך כל הצלחות 96-ובכן assay עבור 45 s בצנטריפוגה מלמעלה בטבלה עם microplate הותאם רוטור (250 x g עבור 45 s ב- 20 ° C). ציון בארות כל לוחית שליטה. הדבר נעשה על ידי ספירת והקלטה מספר החיות חיים וגם מתים כל היטב. תולעים מתים יכול להיות מבודלים מהקבצים תולעים בחיים על ידי חוסר תנועה מוחלט שלהם. לעורר תנועה בעיר וורמס בחיים על ידי הטלת את הצלחת היטב 96 מ כ- 7 ס מ על גבי המשטח מיקרוסקופ ויבתר תוך התבוננות דרך העיינית של המצלמה עבור כל תגובה עורר. תולעים מתים לא יגיבו, הסמוך מעבדה החברים אולי לא מעריך את הרעש חוזרות. עבור לוחות מבחן, לספור, להקליט רק בארות המכיל תולעים בשידור חי. כאשר נוצרת תולעת בשידור חי, לספור כל החיות חיים וגם מתים בתוך הבאר הזו, יחד עם מיקום טוב ו צלחת.הערה: זה לעיתים קרובות שימושי להבקיע מחדש את הצלחות לאחר > 99% של שליטה שלילי תולעים מתים. במסכים בקנה מידה גדול, זה עשוי להיות הנקודה הכי טוב לעשות על מניה הראשונית. בכל מקרה, הציון/מחדש-score כמתואר לעיל 11. בדיקה מחדש תרכובות בעת בדיקת רק מספר קטן של המועמד תרכובות (< תרכובות 320), כמו בדיקה חוזרת או מסך המועמד (ראה תוצאות נציג), להגביל את וזמינותו הבארות מרכזי 32 בניסיון למזער תופעות אפשריות הצלחת. זה משאיר הבארות 2 הכי קרוב לקצה הלוח לא מטופלת אבל עדיין המכילה אגר, מזון ותולעים.