Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans
Summary
Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.
Abstract
Caenorhabditis Elegans ist eine nützliche Organismus chemische Einflüsse auf die Physiologie zu Testzwecken. Gesamtorganismus niedermolekularer Bildschirme bieten erhebliche Vorteile für die Identifizierung von biologisch aktiver chemischer Strukturen, die komplexe Phänotypen wie Lebensdauer ändern können. Hier ist ein einfaches Protokoll für die Herstellung von Hunderten von 96-Well-Kultur-Platten mit Recht einheitlich Zahlen von C. Elegans in jede Vertiefung. Als nächstes angegeben wir wie mithilfe dieser Kulturen zum Bildschirm Tausende von Chemikalien für Auswirkungen auf die Lebensdauer der Fadenwurm C. Elegans. Dieses Protokoll nutzt Temperatur empfindliche steriler Stämme, Agar Platte Bedingungen und einfache Tier Umgang um die schnellen und hohen Durchsatz-Produktion von synchronisierten tierischen Kulturen für das Screening zu erleichtern.
Introduction
Hier wird ein Protokoll beschrieben, die für Hochdurchsatz-Screening von chemischen Verbindungen für Auswirkungen auf Caenorhabditis Elegans Lebensdauer entwickelt wurde. Das Protokoll selbst ist leicht anpassbar an andere phänotypische Bildschirme, einschließlich Studien Reporter C. Elegans Stämme nutzen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um eine neuartige biologisch aktive Verbindung, NP1 identifizieren (Nitrophenyl-Piperazin 1), das stark verlängert die Lebensdauer von C. Elegans durch eine diätetische Einschränkung-Mechanismus. NP1 und eine Charakterisierung von seiner Wirkung auf Lebensdauer, einschließlich einer Beschreibung der genetischen Wege im Spiel, war zuvor an anderer Stelle1beschrieben. Dieser Bericht enthält auch eine Beschreibung der Ergebnisse aus eine großtechnische Umsetzung des Bildschirms. Hier beschreiben wir ausführlich viel grösseres die Methodik und das Setup des Bildschirms selbst, das ist für kleine und größere Anwendungen skalierbar.
Das Ziel, das zur Schaffung von dem hier beschriebenen Protokoll geführt wurde, eine C. Elegans Kultur-Plattform zu entwickeln, die für die schnelle Screening der großen chemischen Bibliotheken für neuartige biologisch aktiven Verbindungen zulässig. Während chemische Bildschirme vor der Entwicklung dieses Protokolls durchgeführt wurden, waren hauptsächlich kleine und/oder Kandidat Typ nähert sich2,3. In der Tat, die meisten von den Bildschirmen im Labor auf Zehntausende Verbindungen durchgeführt genutzt Stress-Resistenz-Assays, mit Hits für Langlebigkeit Effekte4gezeigt. Diese Studie versucht stattdessen direkt für Lebensdauer Effekte auf den Bildschirm. Bemerkenswert ist, gab es einige Beschreibungen in der wissenschaftlichen Literatur zum Zeitpunkt der Durchführung groß angelegte chemische Bildschirme mit C. Elegans. In der Tat schien im Vergleich zu anderen Arten von Bildschirmen5,6,7, groß angelegte chemische Screening mit C. Elegans unterbeschäftigt.
Es gab zwei Beschreibungen der großen Skala chemische Bildschirme in C. Elegans , die als Grundlage verwendet wurden, um diesen Ansatz zu entwickeln. Die erste davon war eine elegante Studie von Peter Roy Labor unter Verwendung chemischer Bildschirme Verbindungen zu identifizieren, die die Entwicklung der Tiere stören könnte. Die Studie folgte dann mit einen vorwärts Mutagenese-Bildschirm die genetische Ziele dieser Chemikalien8identifizieren. Das Protokoll in dieser Studie beschriebenen verwendet 24 wohlen Pasteten, das war einfach nicht praktikabel für die spezifischen Bedürfnisse dieser Studie (begrenzten Mengen der Chemikalie in die Bibliothek und die begrenzt verfügbaren Inkubator Raum). Die anderen Studie war Michael Petraschecks innovative und anspruchsvolle kleine Molekül Bildschirm für Lebensdauer verlängern Chemikalien9,10. Dieser Studie wurden 384-Well Platten und flüssige Kulturen. Das andere Hauptmerkmal dieses Bildschirms war die Verwendung von FUDR (5-Fluorodeoxyuridine), chemisch Nachkommenschaft Produktion hemmen. Nach erheblichen Überlegung des Protokolls, die in dieser Studie beschriebenen chemischen Sterilisation und flüssige Kulturen von C. Elegans vermieden werden.
Obwohl FUDR in C. Elegans Lebensdauer Experimente weit verbreitet ist, gab es Bedenken, dass FUDR unerwartete Wechselwirkungen verursachen könnte, oder dass FUDR selbst gewisse Wirkung auf Lebensdauer eine kann. Vor kurzem wurde diese letztere Sorge, zumindest bei einigen Konzentrationen und insbesondere bei 25 ° C11validiert. Um das Problem der Nachkommenschaft Kontamination zu umgehen, C. Elegans Stamm TJ1060 verwendet wurde, die birgt zwei unabhängige Temperatur empfindliche Mutationen (Spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II), die Abschaffung der Spermienproduktion und haben nachgewiesen, dass nützlich sein für Massenkulturen synchrone Populationen12. Diese Sorte war völlig steril bei 25 ° C, aber produzieren Nachkommen wenn bei 15-20 ° c kultiviert Diese Studie verwendete herkömmliche Kulturbedingungen, mit Würmern kriechen auf der Oberfläche des Nährbodens, wie Ergebnisse, die mit flüssigen Kulturen nicht immer reproduzierbar mit konventionellen Agarplatten. Während dieses Phänomen nicht vollständig verstanden ist, wurde nachgewiesen, dass Würmer in flüssigen reagieren auf DR (diätetische Einschränkung) auf eine andere Weise als Würmer kultiviert auf Standardmedien13,14kultiviert. Daher ist es plausibel, dass flüssige Medien einige DR-Mimetika verdecken könnte, die sonst mit dem Bildschirm identifiziert werden würde.
Auf Agar Kulturbedingungen niedergelassen haben, wurden verschiedene Optionen für die Bewertung der Leistung von Brunnen in diesem Test berücksichtigt. Während verschiedene automatisierte oder bildgebenden basierte Assays zur Verfügung standen, erforderte sie Erwerb und Einsatz von technisch anspruchsvollen Geräten, von denen meisten zu teuer waren. Während diese Optionen in Betracht ziehen, galt es zu den vorherigen Lebensdauer Bildschirmen aller Art beziehen. Letztlich verwendet diese Studie eine scoring-Methode aus der Siu Sylvia Lee Lab ganze Genom RNAi Bildschirm für Lebensdauer Phänotypen15angepasst. Insbesondere alle Lebensdauer Platten wurden auf die gleiche Weise aufgestellt, aber nur die Negativkontrollen wurden überwacht. Sobald die Negativkontrolle Platten bestätigt wurden, in der Nähe von kompletten Mortalität haben, wurden von hand Prüfplatten erzielte. In diesem großen Bildschirm wurden positive Ergebnisse bestätigten durch Re-Tests mit frisch zubereiteten Chemikalien, mit dreifacher Ausfertigung der das primäre positive wiederholt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir eine einfache Methode zur Kultivierung von C. Elegans in 96-Well Platten beschrieben. Wir beschreiben diese Kulturen für den Einsatz in chemischen Screening und Lebensdauer Assays, aber sie eignet sich für viele Arten von Tests. Während Multi-gut Kulturbedingungen für chemische Screening gemeldeten8 bisher, weicht Lebensdauer Analyse10einschließlich, der hier beschriebenen Test in mehrfacher Hinsicht. Hier beschriebenen Lebensdauer-Assay nutzt 96-Well Platten, stützt sich auf sterile Mutanten (anstelle von chemischen Sterilisation), Agar Kulturbedingungen verwendet, nutzt einfache Flüssigkeit, die Handhabung, um Würmer zu verschieben und wird manuell am Endpunkt ausgewertet. Die unterschiedlichen Ansätze in diesem Assay verwendet möglicherweise Hilfe für Forscher auf der Suche nach screening-Verfahren, die zu diesen Bedingungen gehören.
Wesentliche Elemente dieses Protokolls im Zentrum vor allem der Qualität der Platten produziert für den Assay. Erstens bei der Platten ist es zwingend notwendig, dass die Agar-Oberfläche Blasen-und andere Mängel ist. Diese Variationen in der Agar-Oberfläche führen fast immer zu wühlen und Verlust des Brunnens. Zweitens setzt dieses Protokoll auf abtrocknen Flüssigkeiten, die während der Installation und betäubte hinterlegt. Es ist wichtig, dass diese Flüssigkeiten werden vollständig entfernt, aber der Agar wird nicht austrocknen. Gerüchten zufolge scheint es, dass Würmer in Vertiefungen, die nicht vollständig getrocknet (Schwimmen in Flüssigkeit) länger leben als ordnungsgemäß getrockneten Brunnen während übermäßig Trocknen der Platten zu Austrocknung und Rissbildung des Nährbodens, das führt führt zu wühlen und Verlust Wurm. Ein weiterer entscheidender Bestandteil dieses Protokolls ist sterile Bedingungen beibehalten. Wie bei jedem Assay Lebensdauer gibt es eine Menge Arbeit beteiligt mit dem Teller-Setup, und viele Möglichkeiten und Zeit für Assay Kontamination zu begleichen und wachsen auf den Tellern zu ruinieren.
Während der hier beschriebenen Lebensdauer-Test für das Screening von Verbindungen in C. Elegansnützlich ist, ist es beschränkt sich auf bestimmte genetische Hintergründe, wie es stützt sich auf eine Temperatur empfindlich (ts) sterile Sorte; Wir verwendeten TJ1060, die hohe Sterilität Penetranz hat. Dies schränkt die Stämme zur Verfügung für das Screening mit dieser Methode. Alternative Ansätze einschließlich Kreuzung ts sterile Mutationen in den gewünschten Hintergrund oder mit chemischen Sterilisation. Chemische Sterilisation mit diesem Test haben wir nicht versucht, aber es sollte möglich sein. Mögliche Hürden gehören die Würmer den Sterilisator Inverkehrbringen, zum richtigen Zeitpunkt und in der richtigen Dosis. Das Protokoll beschrieben verwendet hier einen liquiden Dispenser, der ist schnell, aber erscheint nicht auf Erwachsene effektiv zu verzichten. Also, diese Würmer auf den Tellern zu entwickeln und müssen daher mit der Sterilisation chemische auf den Tellern behandelt werden. Bestimmung der optimalen Dosis und Zeitpunkt wäre wichtig für den Erfolg. Alternative Strategien gehören mit einer Abgabe Methode, die Erwachsene bewegen können. In der Vergangenheit haben wir festgestellt, dass Maschinen in der Lage zu erkennen und sortieren Erwachsene in der Regel viel langsamer als die einfache liquid Handler die homogene Schlämme von suspendierten Larve verzichten kann.
Im Allgemeinen verwenden wir diese Methode, um schnell Bildschirm Chemikalien und Behandlungen für große positive Auswirkungen auf die Lebensdauer. Die Methode ist besonders effektiv, wenn Sie mit mehreren Dosen verwendet, hohe Zahlen zu replizieren, und eine engmaschige Überwachung der Negativkontrollen, die immer gepflegt und unter den Prüfplatten durchsetzt. Positivkontrollen sind auch nützlich beim Entwerfen und implementieren die Bildschirme in diesem Manuskript beschrieben. Jedoch um eine effektive positiv zu sein, müsste die Steuerung ziemlich potent und/oder sehr robust sein. Wenn der Bildschirm ursprünglich bereitgestellt wurde, konnte eine entsprechend starke und robuste Verbindung nicht identifiziert werden. Derzeit gibt es viele Berichte in der Literatur “Altern” der wahrscheinliche Kandidaten für Positivkontrollen nützlich in den Bildschirmen des hier beschriebenen. Wie im Abschnitt Kandidat Bildschirm des Abschnitts erwarteten Ergebnisse dieser Handschrift und in Abbildung 2 und Tabelle 1beschrieben, ist die Verbindung NP1 eine wirksame positive Kontrolle für diesen Bildschirm. Wir bestätigen im Allgemeinen positiven Hits aus dieser Bildschirme mit standard-Lebensdauer-Assays auf 3 mm Kultur Platten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dipa Bhaumik, Aaron Miller und Bob Hughes für technische Hilfe. Stämme lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Wir sind dankbar für Georgia Woods und Mitglieder der Lithgow, Kapahi und Melov Labs für nützliche Diskussionen. M.l. wurde vom National Institute of Health (NIH) Ausbildung Grant T32 AG000266 und ein Ellison Medical Foundation/American Federation von Aging Postdoc Forschungsstipendium gefördert. Diese Arbeit durch einen Zuschuss von BioAge Labs unterstützt wurde, ein Larry L. Hillblom Foundation Grant sowie National Institutes of Health gewährt UL1024917, Förderung der interdisziplinären Forschungs-Konsortium auf Geroscience und 1R01AG029631-01A1, G.J.L.
Materials
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
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