Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans
Summary
Aquí describimos un protocolo simple para producir rápidamente cientos de agar medios de crecimiento nematodos, placas 96 pocillos con un número constante de Caenorhhabditis elegans por pozo. Estas culturas son útiles para la detección fenotípica de organismos enteros. Nos centramos aquí en el uso de estas culturas a los productos químicos de la pantalla para efectos de Pro-longevidad.
Abstract
Caenorhabditis elegans es un organismo útil para pruebas de efectos químicos en la fisiología. Pantallas de molécula pequeña de todo organismo ofrecen ventajas significativas para identificar estructuras químicas biológicamente activas que pueden modificar los fenotipos complejos como la vida útil. Se describe aquí es un protocolo simple para producir cientos de placas de cultivo de 96 pozos con un número bastante consistente de C. elegans en cada pozo. A continuación, especificamos cómo utilizar estas culturas a pantalla miles de sustancias químicas de efectos sobre la vida del nematodo C. elegans. Este protocolo hace uso de cepas estériles sensibles de temperatura, las condiciones de la placa de agar y sencillo manejo para facilitar la producción de rápido y alto rendimiento de las culturas animales sincronizadas para la detección de animales.
Introduction
Aquí se describe un protocolo que fue desarrollado para el cribado de alto rendimiento de compuestos químicos para efectos sobre la vida útil de los elegans de Caenorhabditis . El protocolo sí mismo es fácilmente adaptable a otras pantallas fenotípicas, incluyendo estudios utilizando las cepas de C. elegans de reportero. Este protocolo fue utilizado con éxito para identificar un compuesto biológicamente activo novela, NP1 (nitrofenil-piperazina 1), que extiende fuertemente la vida de C. elegans a través de un mecanismo de restricción dietética. NP1 y una caracterización de su efecto sobre la vida, incluyendo una descripción de las vías genéticas en el juego, fue previamente descrito en otra parte1. Ese informe también incluye una descripción de los resultados de una implementación a gran escala de la pantalla. Aquí describimos con mucho más detalle la metodología y la configuración de la pantalla, que es escalable para ambas aplicaciones de pequeña y gran escala.
El objetivo que llevó a la creación del protocolo descrito aquí era desarrollar una plataforma de cultura de C. elegans que permitió la rápida proyección de grandes librerías de química de nuevos compuestos biológicamente activos. Mientras pantallas de química se han realizado antes del desarrollo de este protocolo, estos fueron principalmente en pequeña escala o tipo de candidato acerca a2,3. De hecho, la mayoría de las pantallas realizadas en el laboratorio en decenas de compuestos utilizados ensayos de resistencia de tensión, con golpes de ser evaluados para la longevidad efectos4. Este estudio buscó en cambio directamente la pantalla para efectos de la vida. Sorprendentemente, hubo pocas descripciones en la literatura científica a la hora de realizar pantallas químicas a gran escala con C. elegans. De hecho, en comparación con otros tipos de pantallas5,6,7, proyección química a gran escala con C. elegans parece ser subempleados.
Había dos descripciones de pantallas químicas a gran escala en C. elegans que fueron usados como base para desarrollar este enfoque. La primera de ellas fue un elegante estudio de laboratorio de Peter Roy utilizando pantallas químicas para identificar compuestos que podrían perturbar el desarrollo de los animales. El estudio siguió entonces con una pantalla de mutagénesis hacia delante para identificar los objetivos genéticos de estos productos químicos8. El protocolo descrito en este estudio utiliza patés de 24 pocillos, que era simplemente inviable para las necesidades específicas de este estudio (una cantidad limitada de producto químico en la biblioteca y espacio de incubadora disponible limitado). El otro estudio fue innovador y ambiciosa molécula pequeña pantalla de Michael Petrascheck vida útil extendiendo productos químicos9,10. Ese estudio utilizó placas de 384 pocillos y culturas líquidas. La otra característica principal de esta pantalla fue el uso de FUDR (5-fluorodeoxyuridine) para inhibir químicamente la producción de progenie. Después de la consideración considerable del protocolo descrito en este estudio, se evitaron culturas líquidas de C. elegans y esterilización química.
Aunque FUDR es ampliamente utilizado en experimentos de vida de C. elegans , había preocupaciones que FUDR puede causar interacciones entre drogas no previstos, o FUDR sí puede tener algún efecto en la vida. Recientemente esta última preocupación ha sido validada, al menos en algunas concentraciones y, en particular en 25 ° C11. Para evitar el problema de la contaminación de la progenie, se utilizó C. elegans cepa TJ1060, que alberga dos mutaciones sensibles de temperatura independiente (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) que suprimen la producción de espermatozoides y se han demostrado para ser útil culturas masivas de poblaciones sincrónica12. Esta cepa fue totalmente estéril a 25 ° C, pero produce progenie cuando cultivadas en 15-20 ° C. Este estudio utiliza las condiciones de cultivo convencional, con gusanos arrastrándose sobre la superficie del agar, como resultados obtenidos con cultivos líquidos no siempre son reproducibles con placas convencionales. Mientras que este fenómeno no se entiende completamente, se ha demostrado que gusanos cultivan en líquido responden a DR (restricción dietética) de manera diferente que los gusanos cultivados en medios estándar13,14. Por lo tanto es plausible que medios líquidos podrían enmascarar algunos miméticos de DR que de lo contrario se identificaría con la pantalla.
Habiéndose establecido en las condiciones de cultivo de agar, se consideraron diferentes opciones para que el rendimiento de los pozos en este ensayo. Mientras que varios ensayos basados automatizados o imágenes estaban disponibles, exigía adquisición y despliegue de técnicamente difícil dispositivos, la mayoría de los cuales era prohibitivamente cara. Mientras que teniendo en cuenta estas opciones, es esencial referirse a pantallas anteriores de la vida útil de todo tipo. En última instancia, este estudio utilizó un método de puntuación adaptado de pantalla de ARNi de Siu Sylvia Lee Lab genoma entero de fenotipos de vida15. Específicamente, se establecieron todas las placas de la vida útil de la misma manera, pero sólo los controles negativos fueron monitoreados. Una vez que las placas control negativo fueron confirmadas para tener cerca de mortalidad total, las placas de prueba fueron anotadas a mano. En esta pantalla a gran escala, positivos fueron confirmados por nueva prueba con productos químicos recién preparadas, con triplicado las repeticiones de los primarios positivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos descrito un método simple para el cultivo de C. elegans en placas de 96 pocillos. Describimos estas culturas para el uso en química investigación y análisis de vida útil, pero puede utilizarse para muchos tipos de ensayos. Mientras que las condiciones de cultivo bien múltiples para la detección química han sido previamente reportados8, incluyendo análisis de vida útil10, el análisis aquí descrito difiere de varias maneras. El ensayo de vida descrito aquí utiliza placas de 96 pocillos, se basa en mutantes estériles (en lugar de esterilización química), utiliza las condiciones de cultivo de agar, utiliza líquido simple manipulación para mover gusanos y manualmente se anotó al final. Los diferentes enfoques utilizados en este ensayo pueden ser de ayuda a los investigadores en busca de métodos que incluyen estas condiciones de cribado.
Elementos cruciales en el presente Protocolo centran principalmente en la calidad de las placas para el ensayo. En primer lugar, al hacer las placas es imprescindible que la superficie del agar está libre de burbujas y otras imperfecciones. Estas variaciones en la superficie del agar casi siempre conducen a la madriguera y la pérdida del pozo. En segundo lugar, este protocolo se basa en secar líquidos depositados durante las etapas de configuración y drogando. Es fundamental que estos líquidos se eliminan totalmente, sino que el agar no ser desecado. Anecdóticamente, parece que gusanos en pozos que no están completamente secos (natación en líquido) viven más de pozos debidamente secas, mientras que exceso de secado de las placas conduce a la desecación y el agrietamiento del agar, que conduce al gusano madriguera y pérdida. Otro elemento fundamental de este protocolo es manteniendo condiciones de esterilidad. Como con cualquier análisis de la vida, hay mucho trabajo involucrado con la configuración de la placa, y existen muchas oportunidades y tiempo para arruinar contaminación para asentarse y crecer en las placas de ensayo.
Mientras que el ensayo de vida útil se describe aquí es útil para la detección de compuestos en C. elegans, se limita a fondos genéticos particulares, como se basa en una cepa estéril temperatura sensible (ts); Utilizamos TJ1060, que tiene penetrancia alta esterilidad. Esto restringe las cepas disponibles para la detección con este método. Enfoques alternativos incluyendo cruzar ts mutaciones estéril en el fondo deseado o el uso de esterilización química. No hemos intentado esterilización química con este ensayo, pero debería ser posible. Obstáculos potenciales incluyen poner el esterilizador en los gusanos en el momento correcto y en la dosis adecuada. El protocolo descrito aquí utiliza un dosificador de líquido que es rápido, pero no aparece para dispensar a adultos con eficacia. Así, estos gusanos se desarrollan en las placas y por lo tanto deben ser tratados con la esterilización química en las placas. Determinar la dosis óptima y el tiempo sería importantes para el éxito. Estrategias alternativas incluyen el uso de un método de distribución que puede mover a adultos. En el pasado, hemos encontrado que máquinas capaces de identificar y ordenar los adultos son generalmente mucho más lentas que los controladores líquidos simple, que pueden dispensar mezclas homogéneas de suspensión de la larva.
En general, nosotros usamos este método rápidamente de pantalla productos químicos y tratamientos para grandes efectos positivos en la vida. El método es particularmente eficaz cuando se utiliza con dosis múltiples, alta replicar número y cerrar monitoreo de controles negativos que se mantienen siempre e intercalados entre las placas de prueba. Controles positivos son también útiles al diseñar e implementar las pantallas descritas en este manuscrito. Sin embargo, para ser un positivo eficaz, el control tendría que ser bastante potente y muy robusta. Cuando originalmente se desplegó la pantalla, no se pudieron identificar un compuesto adecuadamente potente y robusto. Actualmente, hay muchos informes en la literatura de ‘envejecimiento’ de candidatos para los controles positivos útiles en las pantallas que se describen aquí. Como se describe en la sección de la pantalla de candidatos de la sección de resultados esperados de este manuscrito y en la figura 2 y tabla 1, el compuesto NP1 es un eficaz control positivo para esta pantalla. Generalmente se confirman resultados positivos de estas pantallas con ensayos de vida útil estándar en placas de 3 mm.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dipa Bhaumik, Aaron Miller y Bob Hughes para asistencia técnica. Las cepas fueron proporcionadas por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Agradecemos a los bosques de Georgia y miembros de Lithgow, Kapahi y Melov Labs para discusiones útiles. M.L. fue apoyada por los institutos nacionales de salud (NIH) formación Grant T32 AG000266 y un Ellison Medical Foundation/American Federación de envejecimiento Post-Doctoral beca de investigación. Este trabajo fue financiado por una subvención de los laboratorios de BioAge, una subvención de Larry L. Hillblom Foundation, así como institutos nacionales de salud concede UL1024917, apoyar el consorcio de investigación interdisciplinaria en Geroscience y 1R01AG029631-01A1 a G.J.L.
Materials
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
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