Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans
Summary
Aqui descrevemos um protocolo simples para produzir rapidamente centenas de ágar de mídia de crescimento nematoide, placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de Caenorhhabditis elegans por bem. Estas culturas são úteis para a seleção fenotípica de organismos toda. Nós focamos usando essas culturas para produtos químicos de tela para efeitos de pro-longevidade.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um organismo útil para testar os efeitos químicos sobre fisiologia. Telas de pequenas moléculas de todo organismo oferecem vantagens significativas para a identificação de estruturas químicas biologicamente ativas que podem modificar fenótipos complexos tais como expectativa de vida. Aqui descrito é um protocolo simples para produzir centenas de placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de c. elegans em cada poço. Em seguida, especificamos como usar essas culturas para tela milhares de produtos químicos para efeitos sobre a expectativa de vida do nemátodo c. elegans. Este protocolo faz uso de cepas estéril sensível de temperatura e condições de placa de ágar simples animal para facilitar a produção rápida e alta taxa de transferência das culturas animais sincronizadas para rastreio de manipulação.
Introduction
Aqui um protocolo é descrito que foi desenvolvido para a seleção de alta taxa de transferência de compostos químicos para efeitos na expectativa de vida Caenorhabditis elegans . O protocolo em si é facilmente adaptável para outras telas fenotípicas, incluindo estudos utilizando cepas de c. elegans de repórter. Este protocolo foi utilizado com sucesso para identificar um novo composto biologicamente ativo, PN1 (nitrofenil-piperazina 1), que fortemente se estende a vida útil de c. elegans , através de um mecanismo de restrição dietética. Pn1 e uma caracterização do seu efeito sobre a expectativa de vida, incluindo uma descrição das vias genéticas em jogo, foi anteriormente descritos em outra parte1. O relatório também inclui uma descrição dos resultados de uma implementação em larga escala da tela. Aqui descrevemos mais detalhadamente a metodologia e a configuração da tela em si, que é escalável para ambas as aplicações de pequena e grande escala.
O gol que levou à criação do protocolo descrito aqui foi desenvolver uma plataforma de cultura de c. elegans que permitiu para a seleção rápida de grandes bibliotecas químicas para romance compostos biologicamente ativos. Enquanto telas químicas foram realizadas antes do desenvolvimento do presente protocolo, estas foram principalmente em pequena escala e/ou tipo de candidato se aproxima de2,3. Na verdade, a maioria das telas realizadas no laboratório em dezenas de compostos utilizados ensaios de resistência do stress, com hits, sendo projectados para longevidade efeitos4. Em vez disso, este estudo procurou diretamente da tela para efeitos de expectativa de vida. Surpreendentemente, houve poucas descrições na literatura científica aquando da realização de telas químicas de grande escala com c. elegans. Com efeito, em comparação com outros tipos de telas5,6,7, triagem de química em larga escala usando c. elegans parecia ser subempregados.
Havia duas descrições das telas de química de grande escala em c. elegans que foram usadas como base para desenvolver esta abordagem. O primeiro deles foi um elegante estudo de laboratório de Peter Roy usando telas químicas para identificar compostos que poderiam perturbar o desenvolvimento dos animais. O estudo seguiu então com uma tela de mutagénese frente para identificar os alvos genéticos destes produtos químicos8. O protocolo descrito nesse estudo usado pates 24-bem, que foi simplesmente impraticável para necessidades específicas do presente estudo (quantidades limitadas de química na biblioteca e espaço limitado disponível incubadora). Outro estudo foi de Michael Petrascheck inovador e ambiciosa pequeno-molécula tela para expectativa de vida estendendo produtos químicos9,10. Esse estudo usou placas boas 384 e culturas líquidas. A outra característica principal desta tela foi o uso de FUDR (5-fluorodeoxyuridine) para inibir a produção de descendência quimicamente. Após considerável consideração do protocolo descrito nesse estudo, foram evitadas tanto esterilização química e culturas líquidas de c. elegans .
Embora FUDR é amplamente utilizado em experiências de vida útil de c. elegans , havia preocupações que FUDR podem causar interações medicamentosas imprevistos, ou aquele FUDR em si pode ter algum efeito na expectativa de vida. Recentemente esta última preocupação foi validada, pelo menos em algumas concentrações e em particular a 25 ° C11. Para contornar o problema da contaminação de progênie, c. elegans estirpe TJ1060 foi usado, que abriga duas mutações sensíveis de temperatura independentes (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) que suprimir a produção de espermatozoides e tem sido demonstrado para ser útil para culturas em massa das populações síncrona12. Esta estirpe foi completamente estéril a 25 ° C, mas irá produzir descendência quando cultivadas em 15-20 ° C. Este estudo usado condições de cultura convencional, com vermes rastejando na superfície do ágar, conforme os resultados obtidos com as culturas de líquido nem sempre são reproduzíveis com placas de ágar convencional. Enquanto este fenômeno não é completamente compreendido, foi demonstrado que minhocas cultivadas em líquido responder a DR (restrição dietética) de uma maneira diferente do que vermes cultivadas na mídia padrão13,14. Assim, é plausível que media líquidos pode mascarar alguns mimetics DR que caso contrário seria identificado com a tela.
Tendo resolvido sobre as condições de cultura de ágar, consideraram-se diferentes opções para pontuar o desempenho dos poços neste ensaio. Enquanto vários ensaios com base automatizados ou imagem estavam disponíveis, eles exigiram a aquisição e implantação de tecnicamente desafiador dispositivos, a maioria dos quais eram proibitivamente cara. Enquanto essas opções a considerar, era essencial para se referir a anterior telas de expectativa de vida de todos os tipos. Em última análise, este estudo usou um Pontuação método adaptado de tela de RNAi do Siu Sylvia Lee laboratório genoma inteiro para vida útil fenótipos15. Especificamente, todas as placas de expectativa de vida foram criadas da mesma forma, mas somente os controles negativos foram monitorados. Uma vez que as placas de controle negativo foram confirmadas para ter perto de mortalidade completa, placas de teste foram marcadas com a mão. Nesta tela em grande escala, positivos foram confirmados por re-testes com produtos químicos preparados na hora, usando triplicado repete o primário positivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um método simples para cultivo de c. elegans em placas de 96 poços. Descrevemos essas culturas para uso na análise química e ensaios de vida útil, mas eles podem ser usados para vários tipos de ensaios. Enquanto as condições de cultura multi bem para rastreio química anteriormente foram relatados8, incluindo análise de expectativa de vida10, o ensaio descrito aqui difere de várias maneiras. O ensaio de expectativa de vida descrito aqui utiliza placas de 96 poços, baseia-se na estéril mutantes (em vez de esterilização química), usa as condições de cultura de ágar, usa líquido simples manipulação para mover vermes e manualmente é marcado no ponto de extremidade. As diferentes abordagens utilizadas neste ensaio podem ser de ajuda para investigadores à procura de métodos que incluem estas condições de pré-selecção.
Elementos cruciais para este protocolo centro principalmente na qualidade das placas produzidas para o ensaio. Primeiro, quando fazendo placas é imperativo que a superfície do agar é livre de borbulhas e outras imperfeições. Estas variações na superfície do agar quase sempre levam a construção de galerias e perda do poço. Em segundo lugar, esse protocolo depende secando líquidos depositados durante as fases de instalação e drogado. É fundamental que estes líquidos são completamente removidos, mas o ágar não tornar-se seco. Curiosamente, parece que os vermes em poços que não são completamente seco (natação em líquido) viver mais que poços devidamente secados, enquanto o ressecamento das placas leva à dessecação e rachamento do ágar, que leva ao verme burrowing e perda. Outro elemento crucial do presente protocolo é manutenção de condições estéreis. Como com qualquer ensaio de vida útil, há muito trabalho envolvido com a configuração da placa, e muitas oportunidades e tempo existem para arruinar a contaminação para se estabelecer e crescer com as placas de ensaio.
Enquanto o ensaio de expectativa de vida descrito aqui é útil para o rastreio de compostos em c. elegans, que se limita a determinado origens genéticas, como ele se baseia em uma estirpe sensível (ts) estéril de temperatura; usamos TJ1060, que tem penetrância alta esterilidade. Isso restringe as disponível para a seleção de cepas com este método. Alternativa se aproxima incluindo cruzando ts mutações estéril para o plano de fundo desejado ou usando a esterilização química. Nós não tentamos esterilização química com este ensaio, mas deve ser possível. Obstáculos potenciais incluem colocação o esterilizador nos vermes na fase correta e na dose adequada. O protocolo descrito aqui usa um líquido dispensador que é rápido, mas não aparece para dispensar adultos eficazmente. Então, esses vermes desenvolvem nas placas e, portanto, devem ser tratadas com a esterilização química nas placas. Determinar a dose ótima e o tempo seria importantes para o sucesso. Estratégias alternativas incluem o uso de um método de distribuição que pode mover-se adultos. No passado, nós encontramos que máquinas capazes de identificar e classificar os adultos são geralmente muito mais lentas do que os manipuladores de líquido simples, que podem dispensar lamas homogéneas de larva suspenso.
Em geral, usamos este método rapidamente produtos químicos tela e tratamentos para grandes efeitos positivos sobre a expectativa de vida. O método é particularmente eficaz quando utilizado com doses múltiplas, alta replicar os números e fechar o monitoramento dos controles negativos que são sempre mantidos e intercaladas entre as placas de teste. Controles positivos também são úteis quando projetando e implementando as telas descritas neste manuscrito. No entanto, para ser um positivo eficaz, o controle precisa ser bastante potente e/ou altamente robusto. Quando a tela foi originalmente implantada, um composto suficientemente potente e robusto não pôde ser identificado. Atualmente, existem muitos relatos na literatura ‘envelhecimento’ dos prováveis candidatos para controles positivos útil nas telas descritas aqui. Conforme descrito na seção de tela candidato da seção resultados esperados este manuscrito e na Figura 2 e tabela 1, o composto PN1 é um eficaz controlo positivo para esta tela. Nós confirmamos geralmente positivas correspondências a partir de telas com ensaios de vida útil padrão em placas de cultura de 3 mm.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dipa Bhaumik, Aaron Miller e Bob Hughes para assistência técnica. Cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Estamos gratos à Georgia Woods e membros de Lithgow, Kapahi e Melov Labs para debates úteis. M.L. foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) formação Grant T32 AG000266 e um Ellison Medical Foundation/American Federação de envelhecimento pesquisa Doctoral Fellowship. Este trabalho foi financiado por um subsídio da BioAge Labs, um subsídio de Larry L. Hillblom Foundation, bem como institutos nacionais de saúde concede UL1024917, apoiando o consórcio de pesquisa interdisciplinar em Geroscience e 1R01AG029631-01A1 para G.J.L.
Materials
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
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