طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لسرعة إنتاج مئات من وسائط النمو السلكية أجار، لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة من ايليجانس كاينورهابديتيس لكل بئر. هذه الثقافات مفيدة لفحص الكائنات كله المظهرية. نحن نركز هنا على استخدام هذه الثقافات إلى شاشة المواد الكيميائية للآثار المؤيدة طول العمر.
Abstract
ايليجانس كاينورهابديتيس كائن مفيدة لاختبار تأثيرات المواد الكيميائية على علم وظائف الأعضاء. الكائن الحي كله جزيء صغير شاشات عرض مزايا هامة لتحديد الهياكل الكيميائية النشيطة بيولوجيا التي يمكن تعديلها تعمل معقدة مثل عمر. الموصوفة هنا بروتوكول بسيط لإنتاج مئات لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة إلى حد ما من C. ايليجانس في كل بئر. المقبل، ونحن تحديد كيفية استخدام هذه الثقافات إلى الشاشة الآلاف من المواد الكيميائية للآثار على عمر ديدان أسطوانية C. ايليجانس. هذا البروتوكول يجعل استخدام سلالات عقيمة حساس درجة الحرارة وظروف بلايت أجار والحيوان بسيطة التعامل مع تيسير إنتاج الثقافات الحيوان متزامنة للفحص السريع وارتفاع الإنتاجية.
Introduction
هنا هو وصف بروتوكول تم تطويره لفحص إنتاجية عالية من المركبات الكيميائية للآثار على عمر ايليجانس كاينورهابديتيس . البروتوكول نفسه سهولة التكيف للشاشات المظهرية الأخرى، بما في ذلك دراسات استخدام سلالات C. ايليجانس المراسل. هذا البروتوكول واستخدمت بنجاح لتحديد مركب نشيطة بيولوجيا رواية، NP1 (نيتروفينيل-الببرازين، 1)، الذي يمتد بقوة عمر C. ايليجانس من خلال إليه قيود غذائية. NP1 ووصف لأثر ذلك على عمر، بما في ذلك وصف للمسارات الجينية في اللعب، وكان سابقا في أماكن أخرى ووصف1. أن يتضمن التقرير أيضا وصفاً للنتائج من تطبيق على نطاق واسع من الشاشة. هنا يصف لنا بالكثير من التفصيل أكبر المنهجية والإعداد للشاشة نفسها، وقابلة للتطوير للتطبيقات الصغيرة والكبيرة الحجم.
وكان الهدف الذي أدى إلى إنشاء البروتوكول هو موضح هنا لتطوير منصة ثقافة C. ايليجانس يسمح بالفحص السريع للمكتبات الكيميائية الكبيرة للمركبات النشيطة بيولوجيا رواية. بينما الشاشات الكيميائية قد أجريت قبل وضع هذا البروتوكول، هذه كانت أساسا الصغيرة و/أو نوع مرشح النهج2،3. في الواقع، تستخدم معظم الشاشات أداؤها في المختبر على عشرات مركبات فحوصات مقاومة الإجهاد، مع يجري فرزهم لطول العمر آثار4مرات. هذه الدراسة تسعى بدلاً من ذلك إلى الشاشة مباشرة للآثار عمر. بشكل ملحوظ، كانت هناك بعض الأوصاف في الكتابات العلمية في وقت أداء شاشات كيميائية واسعة النطاق مع C. ايليجانس. في الواقع، مقارنة بالأنواع الأخرى من شاشات5،،من67، الفحص الكيميائية على نطاق واسع استخدام C. ايليجانس ويبدو أن العمالة الناقصة.
وهناك أوصاف اثنين من شاشات كيميائية واسعة النطاق في C. ايليجانس التي استخدمت كأساس لتطوير هذا النهج. وكان أول هذه دراسة أنيقة من بيتر روي المختبر باستخدام شاشات الكيميائية للتعرف على المركبات التي يمكن التشويش تنمية الحيوانات. ثم تابعت الدراسة مع شاشة الطفرات إلى الأمام لتحديد أهداف هذه المواد الكيميائية8الوراثية. استخدام البروتوكول الموصوفة في هذه الدراسة باتيس 24-جيدا، وهو ببساطة غير قابلة للتطبيق لتلبية الاحتياجات المحددة لهذه الدراسة (كميات محدودة من المادة الكيميائية في مكتبة ومساحة حاضنة المتاحة محدودة). وكانت الدراسة الأخرى الشاشة مايكل بيتراشيك جزيء صغير المبتكرة والطموحة لتوسيع نطاق المواد الكيميائية9،10عمر. هذه الدراسة تستخدم لوحات 384-جيدا والثقافات السائل. وكان السمة الرئيسية الأخرى لهذه الشاشة استخدام فودر (5-فلوروديوكسيوريديني) تمنع إنتاج ذرية كيميائيا. بعد كبير النظر في البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة، تم تفادي التعقيم الكيميائي والثقافات السائل من C. ايليجانس .
على الرغم من أن فودر يستخدم على نطاق واسع في تجارب عمر C. ايليجانس ، كانت هناك مخاوف أن فودر قد يسبب تفاعلات العقاقير غير متوقعة، أو أن فودر نفسها قد يكون له بعض التأثير على عمر. مؤخرا هذا القلق الأخير تم التحقق من، على الأقل في بعض التركيزات وخاصة في 25 درجة مئوية11. للالتفاف على مشكلة التلوث بذرية، تم استخدام سلالة C. ايليجانس TJ1060، التي تؤوي اثنين من الطفرات حساسة مستقلة في درجات الحرارة (جمعية مهندسي البترول-9 (hc88) الأول؛ rrf-3(b26)II) أن إلغاء إنتاج الحيوانات المنوية، ولقد ثبت أن تكون مفيدة للثقافات الجماعية للسكان متزامن12. هذه السلالة عقيمة تماما عند 25 درجة مئوية، ولكن سوف تنتج ذرية عند مثقف في 15-20 درجة مئوية. استخدمت هذه الدراسة ظروف الثقافة التقليدية، مع الديدان الزحف على سطح أجار، النتائج التي تم الحصول عليها مع الثقافات السائلة ليست دائماً استنساخه بلوحات أجار التقليدية. في حين أن هذه الظاهرة ليست مفهومة تماما، فإنه قد ثبت أن الديدان مثقف في الاستجابة السائل للدكتور (تقييد الغذائية) بطريقة مختلفة من الديدان مثقف في وسائل الإعلام القياسية13،14. ولذلك فمن المعقول أن السائل وسائل الإعلام يمكن أن تخفي بعض mimetics الدكتور خلاف ذلك سوف يتم تحديدها مع الشاشة.
وقد استقر على شروط الثقافة أجار، اعتبرت خيارات مختلفة لتسجيل أداء الآبار في هذا التحليل. بينما تتوفر فحوصات استناداً إلى مختلف الآلي أو التصوير، أنها استلزمت حيازة ونشر تحديا من الناحية التقنية الأجهزة، معظمها باهظ التكلفة. حين النظر في هذه الخيارات، من الضروري الرجوع إلى السابق عمر الشاشات من جميع الأنواع. وفي النهاية، استخدمت هذه الدراسة أسلوب التهديف مقتبس من الجينوم كله [رني] الشاشة مختبر لي سيلفيا سيو ل تعمل عمر15. على وجه التحديد، تم إعداد جميع عمر لوحات بنفس الطريقة، ولكن تم رصد الضوابط السلبية فقط. متى تأكدت لوحات التحكم السلبي قرب وفيات كاملة، قد سجل لوحات الاختبار باليد. في هذه الشاشة على نطاق واسع، أكدتها إيجابيات إعادة الاختبار مع المواد الكيميائية الطازجة باستخدام تكرار ثلاث نسخ من إيجابيات الأولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا لقد قمنا بوصف طريقة بسيطة لاستزراع C. ايليجانس في لوحات 96-جيدا. يمكننا وصف هذه الثقافات لاستخدامها في الكشف عن المواد الكيميائية وفحوصات عمر، ولكن يمكن استخدامها لأنواع عديدة من الاختبارات. بينما سابقا كانت ظروف الثقافة المتعددة جيدا للفحص الكيميائية المبلغ عنها8، بما في ذلك تحليل عمر10، تختلف المقايسة الموصوفة هنا في عدة طرق. مقايسة عمر الموصوفة هنا تستخدم لوحات 96-جيدا ويعتمد على طفرات العقيمة (بدلاً من التعقيم الكيميائي) ويستخدم أجار الثقافة الشروط، ويستخدم السائل بسيطة التعامل مع نقل الديدان وهو سجل يدوياً في نقطة النهاية. قد يكون النهج المختلفة المستخدمة في هذا التحليل لمساعدة الباحثين تبحث عن فحص الأساليب التي تتضمن هذه الشروط.
مركز العناصر الحاسمة لهذا البروتوكول أساسا على نوعية اللوحات المنتجة للانزيم. أولاً، عندما صنع ألواح يتحتم أن السطح أجار مجاني فقاعات وعيوب أخرى. هذه الاختلافات في السطح أجار تؤدي دائماً تقريبا إلى تختبئ وفقدان البئر. ثانيا، وهذا البروتوكول يعتمد على تجفيف قبالة السوائل المودعة خلال مراحل الإعداد والتخدير. من الأهمية بمكان أن تتم إزالة هذه السوائل تماما، ولكن لا تصبح جفت في أجار. الروايات المتناقلة، ويبدو أن الديدان في الآبار التي ليست تماما المجففة (سباحة في السائل) يعيش أطول من الآبار الجافة بشكل صحيح، بينما الإفراط تجفيف اللوحات ويؤدي إلى جفاف وتكسير لاجار، الأمر الذي يؤدي إلى دودة تختبئ والخسارة. عنصر حاسم آخر من هذا البروتوكول هو الحفاظ على ظروف معقمة. كما مع أي عمر المقايسة، وهناك الكثير من العمل تشارك في إعداد لوحة، وهناك العديد من الفرص والوقت للمقايسة تخريب التلوث تسوية وتنمو على اللوحات.
بينما الإنزيم عمر الموصوفة هنا مفيد لفحص المركبات في C. ايليجانس، فيقتصر على الخلفيات الوراثية خاصة، كما أنها لا تعتمد على سلالة عقيمة حساسة (ts) درجة حرارة؛ كنا TJ1060، الذي قد penetrance العقم عالية. وهذا يقيد سلالات متاحة للفحص مع هذا الأسلوب. النهج البديلة بما في ذلك عبور إتس الطفرات العقيمة إلى الخلفية المطلوبة أو استخدام التعقيم الكيميائي. لقد حاولنا عدم التعقيم الكيميائي مع هذا التحليل، ولكن ينبغي أن يكون ممكناً. وتشمل العقبات المحتملة وضع المطهر على الديدان في المرحلة الصحيحة وفي الجرعة الصحيحة. هنا يستخدم بروتوكول وصف موزع سائلة بسرعة، ولكن لا يبدو أن الاستغناء عن البالغين على نحو فعال. لذا، هذه الديدان وضع على اللوحات ولذلك يجب أن تعامل مع التعقيم الكيميائي على اللوحات. تحديد الجرعة المثلى والتوقيت سيكون مهما للنجاح. وتشمل الاستراتيجيات البديلة استخدام أسلوب الاستغناء عن نقل الكبار. في الماضي، وقد وجدنا أن آلات قادرة على تحديد وفرز البالغين عموما أبطأ بكثير من معالجات السائل البسيطة، التي يمكن الاستغناء عن عجائن متجانسة من اليرقة مع وقف التنفيذ.
وبصفة عامة، نستخدم هذا الأسلوب بسرعة الشاشة المواد الكيميائية والعلاجات لآثار إيجابية كبيرة على عمر. الطريقة فعالة بشكل خاص عند استخدامها بجرعات متعددة، وتكرار أرقام عالية، ورصد دقيق لعناصر سلبية دائماً الحفاظ على ويتخلل بين لوحات الاختبار. عناصر إيجابية مفيدة أيضا عند تصميم وتنفيذ الشاشات الموصوفة في هذه المخطوطة. ومع ذلك، يكون إيجابية فعالة، عنصر التحكم سيلزم قوية إلى حد ما و/أو قوية جداً. عندما تم نشر الشاشة أصلاً، تعذر تعريف مركب قوية ومتينة على نحو ملائم. حاليا، هناك العديد من التقارير في الأدب ‘الشيخوخة’ من المرشحين المحتمل لعناصر إيجابية مفيدة في الشاشات الموصوفة هنا. كما هو موضح في المقطع شاشة مرشح قسم النتائج المتوقعة من هذه المخطوطات، وفي الشكل 2 و الجدول 1, NP1 مجمع عنصر إيجابي فعال لهذه الشاشة. ونؤكد عموما يضرب إيجابية من هذه الشاشات مع فحوصات عمر القياسية على ألواح الثقافة 3 مم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر بهوميك ديبا، آرون ميلر وبوب هيوز للمساعدة التقنية. وقدمت سلالات كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة “برامج الهياكل الأساسية للبحوث” (P40 OD010440). ونحن ممتنون لجورجيا بريتون وودز وأعضاء ليثغو وكابي “معلوف مختبرات” لإجراء مناقشات مفيدة. حركة التحرير أيده AG000266 T32 منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (NIH) واليسون الطبية مؤسسة/أمريكا الاتحاد للشيخوخة شواغر زمالة بحثية. كان يؤيد هذا العمل بمنحه من “مختبرات بيواجي”، على منحة من مؤسسة هيلبلوم L. لاري، فضلا عن “المعاهد الوطنية للصحة” منح UL1024917، دعم “اتحاد البحوث المتعددة التخصصات” في جيروسسينسي، و 1R01AG029631-01A1 إلى G.J.L.
Materials
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
