カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

1. バッファーを準備します。 流体培養基 LB 予混合顆粒 (表を参照) を使用し、製造元の準備のためのプロトコルに従います。 線虫成長メディア (NGM) 寒天培地 ミックス 23 の寒天の g、塩化ナトリウム 3 g、2.5 g バクト ペプトンのし 0.972 L. オートクレーブに脱イオン水と 60 ° C に冷ます、1 mL の 1 M 硫酸マグネシウム (MgSO4) 25 mL の 1 M カリウム リン酸 (KPO4) バッファー (pH 6.0) 追加、1 M 塩化カルシウム (CaCl2) 1 mL と 5 mg/mL (エタノール) でコレステロールの 1 mL。 次亜塩素酸 5 M コ、5 mL の次亜塩素酸ナトリウム溶液 (6%)、および脱イオン H2O 50 mL の容量に 4 mL を混ぜます。 基底 S K2HPO4、6 g の KH2PO4と 1 L、オートクレーブ、脱イオン水の 1 g, 塩化ナトリウム 5 g を混ぜます。 2. 集中エシェリヒア属大腸菌(OP50) の準備 注: この手順には、25 mL の S の基底バッファーにエシェリヒア属大腸菌飽和溶液 1 L が集中しています。 エシェリヒア属大腸菌 (ひずみ OP50) の単一コロニーと流体培養基 LB オートクレーブ (ステップ 1.1) の 5 mL を接種して、37 ° C (250 rpm) を振動で 4-6 時間孵化させなさい。この溶液 0.1 mL を使用して、ポンドの 1 L を 2 L の三角フラスコに接種します。1 L フラスコ一晩 (12-16 h) 37 ° C (250 rpm) を振動で孵化させなさい。 遠心 10,000 × g と、細菌を餌し、離れての残りのメディアをデカントする 4 ° C で 5 分間 500 mL 遠心ボトル 1 L 一晩文化。S 基底 (手順 1.4) 25 mL にペレットを再懸濁します。4 ° C でのストア 3. NGM 培養皿の準備 ワームの大規模な番号を生成するために使用、大衆文化板は、層流の流体自動塗布装置や血清ピペットで 10 cm 培養皿にキャビネットの溶融 (60 ° C) NGM 寒天 (ステップ 1.2) の 30 mL を分配します。一晩乾燥させてください。 ピペット 2 mL を傾斜して回転、平板寒天培地の表面を完全にカバーに広がる各 10 cm プレート集中 OP50 プレート乾燥を許可します。2 週間までの 4 ° C でプレートを格納します。 高スループット スクリーニング用アッセイ培養皿流内閣で 96 well プレートの各ウェルに溶融 NGM 寒天 0.15 mL を分注する自動 8 チャネル ディスペンサーを利用します。使用注意してください井戸は、井戸でアッセイを妥協するワームの穴を掘る泡を欠いています。一晩乾燥させてください。2 週間までの 4 ° C でプレートを格納します。 4. 温度感受性 (ts) 滅菌線虫大量文化の準備 転送の 20 卵を解剖顕微鏡の下で ‘ワーム選択’ (接続されている白金線または製造されたワームにガラス ピペットを選択) を使用して文化を開始する (TJ1060 をひずみ: spe-9 (hc88) 私; 3.1 の手順で作製した培養プレートに rrf-3(b26)II)。20 ° c のプレートを 6 日間、インキュベート (成長の複数の世代移動 20 卵の子孫のコレクション対象にできる)。 視覚的に解剖顕微鏡を用いた妊娠大人 (子宮に卵) の存在を確認します。S プレート ガラス ピペットを使用して基底の 2-3 mL を分注して妊娠の大人を収集します。プレートの周りの液体を手で旋回し、ガラス ピペットを使用して 15 mL チューブに液体を収集します。 ワーム、ペレット、上清を吸引しダウン チューブ (20 ° C で 1.5 分 1,000 x g) スピンします。ワームのペレットに 10 mL の次亜塩素酸溶液 (手順 1.3) を追加し、急速に揺れ 2.5 分ごと 5 分間 5 s. 加温の上から下の方向に手でチューブを振る。 また、スピン ダウン チューブ (1.5 分、1,000 x g);ペレットは、黄色がかった茶色にする必要があります。上清を離れて吸い出しなさい。10 mL の次亜塩素酸溶液を加える卵ペレットとチューブを積極的に振る。1 〜 3 分、時折振動と解剖顕微鏡で外観を監視しながらインキュベートします。目視確認だけの卵されているため、次の手順に進みます。 スピン ・ ダウン チューブ (1.5 分 1,000 x g) と上清を離れて吸い出しなさい。ペレットはない茶色の着色と白する必要があります。注: 次亜塩素酸溶液の除去後って重要な汚染から滅菌テクニックとバッファーを使用する (細菌、真菌、特に) 無駄に貴重な時間と試薬、実験を台無しにすることができます。本研究では、フィルター層流キャビネットを使用し、滅菌ピペットとヒントのみを使用して液体を移動します。 無菌空間でチューブを開きます。S で 3 回ペレットを基底、スピン (1.5 分、1,000 x g) ダウンと吸引離れて上澄みするたびに洗ってください。再度 2-3 mL の S の基底に卵ペレットを中断します。これらの卵は、L1 幼虫 (手順 5) を収集するためにバッファーに一晩ハッチのため今すぐ使用できます。 5. (L1 幼虫c. の Elegansを準備する) 同期のカルチャを取得するバッファーへの線虫卵を孵化 カバー付き滅菌ガラス シャーレに卵ペレットとバッファーをデカントします。2-3 ml の S の基底の血清ピペットを使用して皿にチューブから残りの卵をすすいでください。(ベリー ダンサー軌道シェーカー 20 rpm) の揺れをつけるように、これは孵化を促すことがありますので、混雑を緩和するため基底 S の 5 mL を追加します。卵ハッチ (16-24 h) 時間を許可するように 20 ° C で一晩インキュベートします。食品の不在のためすべて孵化 1st幼虫 (L1) で逮捕します。注: 逸話的な証拠は、新鮮な L1 準備 (採卵後 16 36 h) 生成成虫の最も同期集団であることを示します。 血清ピペットで 15 mL チューブに l1 を収集します。遠心分離機 (1.5 分 1,000 x g) でスピンダウンすると l1、離れて、上清を吸引し、S の 10 mL の次のステップの根元を残しながら、板を孵化から収集されたすべての l1 まで繰り返します。 L1 を含むチューブ、マイクロ ピペット (混合) 後すぐに 0.01 mL を出てし、シードされていない上に分配 (ない大腸菌) NGM プレート。プレート上の l1 の数をカウントします。10 回繰り返すし、各因数で l1 の数の平均値を求めます。一般に、(起動時 20 卵を含む 1 の大量培養プレート) は μ L あたり 1-3 l1 間期待します。 血清ピペットの S の基底、l1 を押しのボリュームを決定します。L1 の総数を推定するため、前の手順で取得した、0.01 mL 当たりワームの断固としたな数の平均値を推定します。一般に、(大衆文化プレート 20 卵を含む) ごとの 10,000-30,000 l1 間期待します。 96 ウェルの分析で、この文化を使用するには、滅菌ラウンド メディア ボトルに μ 1 L1 L1 懸濁液を希釈し、手順 7 に進みます。追加の生成に使用する場合はこの文化c. の elegans文化を大量、手順 6 に進みます。 6. 大規模な同調培養準備 注: L1 ソリューションは、迅速にワームの人口を増加する使用できます。 L1 ソリューションとワームの大規模な番号を生成するには、各大量培養皿の数で最大 5,000 l1 を分配します。4.1-2 の手順で説明するように妊娠大人 2.5 日後 (20 ° C) を収集し、卵を収集する 4.3 の手順に進みます。 ピッキング卵ので次亜塩素酸治療、残りの人口を服従させる前に伝播の複数の次亜塩素酸コレクションすることができます征服された人口を強調、分割した集団が繰り返しそれ逸話的に観察されているよう繰り返し、人口の世代は次亜塩素酸溶体化処理する対象ではありません。 7. 96 ウェル アッセイ プレートのセットアップ 部屋の温度に到達する (手順 3.3 で準備) アッセイ プレートを許可します。その後、流キャビネットの各ウェルに集中 OP50 (2.2 の手順で準備) の 5 μ L を追加します。以前のように、自動の 8 チャネル ディスペンサーを使用します。 自動 8 チャネル ディスペンサーを使用して各ウェルに L1 懸濁液の 10 μ L を追加します。これは懸濁液に 1 μ L あたり L1 で存在しているので好評につき、平均 10 ワームになります。スラリーから l1 の平等な分配を促進するため、積極的に適度にゆっくりと回すと混合ラウンド メディア ボトルから l1 を調剤攪拌棒。 カバー プレートのバッチをボックス, 蓋付きプレートと 2 日間の 25 ° C で孵化させなさい。 8. 1 st日アダルト線虫化学物質での治療 冷凍庫から化合物ライブラリー プレートを外し、続行する前に部屋の温度に達するまでプレートを許可します。注: 化学ライブラリ プレート前述のように、すべてが同じ濃度で、DMSO に溶解し、各ウェルで離散化合物を含む 96 ウェル プレートです。これらのライブラリは、外側の列を使用しないし、各プレートは最大 80 の異なる化学物質。ここで説明したプロトコルでライブラリ濃度は 10 mM です。それは表現型に及ぼす溶媒効果を考慮することが重要です。DMSO 濃度 0.5% でスクリーンをこの検討、一方このレベルをこれらの寿命の試金、低スループット アッセイ、複合原液濃度を選択する可能性が高く、決して超えています。このプロトコルは、寿命変更が行われない16、少なくとも N2 ひずみレベルである 0.25% を超えない。 軽くプレートを使用する前にすぐに 1 分のマイクロ プレート シェーカーで 60 回転で振る。 またはを使用して、自動 96 ウェル液体ハンドラー、化合物の転送 0.75 μ L (DMSO) アッセイ プレートにライブラリ プレートから。液体ハンドラーのピペット チップ (ワームや手順 7.1 から集中 OP50 で寒天培地の表面に液体の ~ 15 μ L を 0.75 μ L のボリュームを提供しているように、慎重にアッセイ プレートに液体の配信中にピペットの深さを制御します。-2)、よく寒天表面を貫通していないと。非常に小さな画面でを除いてマニュアル 8 または 12 マルチ チャンネル ピペットを使用しないでください (< 10 皿)、彼らはエラーとアッセイを妥協する寒天表面の穿刺の結果にしばしばを増やすことができます。 テスト対象ライブラリは、溶媒として DMSO を使用する前提に dmso (ジメチルスルホキシド) 化合物ライブラリー ネガティブ コントロール プレートを準備します。試験板 10 の負の制御板まですべての 5 の 1 のネガティブ コントロール プレートを作る。可能であれば、また肯定的な制御プレートを作る (NP11 20 mM、0.1 mM の最終測定濃度ではこの目的のため、効果的な代表結果セクションを参照してください)。彼らは特に乾燥しやすい、プレートの 2 外柱に化学薬品 (テストや制御) を追加しないでください。 9. 乾燥文化 寒天の表面から液体を削除するには、4-8 h のキャビネットの層流板を乾燥します。これらのプレートは完全に乾燥させますが、枯らしていないかが重要です。いくつかのプレートは、他の人よりも乾燥に時間がかかりますとすべてのプレートを密接に監視し、乾燥するいるとすぐを削除します。プレートの個々 の井戸を視覚的注意による乾燥を確認します。注記: キャビネットの排気速度を含む要因によってこれにかかる時間必要があります経験的に決まります。この乾燥のステップが完全キャビネット用約 4-8 時間かかります。 透明フィルムとプレートをシールし、プレート蓋に置きます。 45 96 ウェル アッセイ プレートをスピン 1,000 x g で s。 25 ° C で反転店プレート 10 長寿のための得点のc. の Elegans文化 まで負の制御板を監視 > 95% 死亡率が観察されます。その後数週間、毎日毎週の最初の 2 つの板を確認してください。同じひずみと種の線虫コホート試験17によって寿命が大幅に異なるを表示できます。注: 記載されている、25 ° C で培養 TJ1060 動物と寿命の試金のためこれらの人口の 95% の死亡率が成人の日 16-20 から発生しました。 陰性対照の井戸に達していると認められるとき、> 95% をマーク、45 のすべての 96 ウェル アッセイ プレート スピンダウンをテーブル トップ遠心分離機 s 適応ローター (250 x 45 g s 20 ° c)。 制御板のすべての井戸をスコアします。これは、カウントし、各ウェルで生きていると死んでいる動物の数を記録します。死んでワームは、動きの完全な欠如によって生きている虫から区別できます。任意の誘発電位の接眼レンズをのぞきながら解剖顕微鏡表面に約 7 cm から 96 ウェル プレートをドロップすることによって生きているワームの動きを誘発します。死んでワームが応答しないと、近くの研究室仲間が反復的な雑音を認めるかもしれない。 テスト プレートのカウント、生きた虫体を含む井戸のみを記録します。ライブのワームを観察すると、よく位置とプレートと一緒に、よくすべての生きていると死んでいる動物を数えます。注: それはしばしば後プレートを再獲得する有用 > ネガティブ コントロール ワームの 99% は死んだ。大型画面で初期スコアリングを行う最高のポイントがあります。いずれの場合も、スコア/再-score 前述のように 11. 化合物の再テスト 候補化合物の数が少ないをテストするとき (< 320 化合物)、再テストまたは候補画面 (代表的な結果を参照してください)、アッセイを 32 の中央の井戸に可能なプレートの影響を最小限に抑えるために制限します。これは、未処理、寒天、食物、およびワームを含むまだプレートの端に最も近い 2 の井戸を残します。