Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans
Summary
Qui descriviamo un protocollo semplice per produrre rapidamente centinaia di agar media di crescita del nematode, piastre di coltura 96 pozzetti con un numero consistente di Caenorhhabditis elegans per pozzetto. Queste culture sono utili per lo screening fenotipico di interi organismi. Qui ci concentriamo sull’utilizzo di queste culture ai prodotti chimici schermo per effetti di pro-longevità.
Abstract
Caenorhabditis elegans è un organismo utile per testare gli effetti chimici sulla fisiologia. Tutto l’organismo piccola molecola schermi offrono vantaggi significativi per l’identificazione di strutture chimiche biologicamente attive che possono modificare i fenotipi complessi come la durata della vita. Descritto qui è un semplice protocollo per la produzione di centinaia di piatti di coltura 96 pozzetti con un numero abbastanza consistente di c. elegans in ciascun pozzetto. Successivamente, abbiamo specificato come utilizzare queste culture allo schermo migliaia di sostanze chimiche per gli effetti sulla durata del nematode c. elegans. Questo protocollo si avvale di ceppi sterili sensibili di temperatura, condizioni di piastra di agar e animale di semplice gestione per facilitare la produzione rapida e di alta velocità effettiva delle culture sincronizzate animale per lo screening.
Introduction
Qui un protocollo è descritto che è stato sviluppato per screening su vasta scala di composti chimici per gli effetti sulla durata della vita di Caenorhabditis elegans . Il protocollo stesso è facilmente adattabile agli altri schermi fenotipici, compresi gli studi utilizzando ceppi di c. elegans di reporter. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per identificare un romanzo composto biologicamente attivo, NP1 (nitrofenil-piperazina 1), che fortemente si estende la durata della vita di c. elegans attraverso un meccanismo di restrizione dietetica. NP1 e una caratterizzazione del suo effetto sulla durata della vita, compresa una descrizione delle vie genetiche in gioco, è stato precedentemente descritto altrove1. Tale relazione include anche una descrizione dei risultati da un’implementazione su larga scala dello schermo. Qui descriviamo molto più dettagliatamente la metodologia e il programma di installazione dello schermo stesso, che è scalabile per applicazioni piccole e grandi dimensioni.
L’obiettivo che ha portato alla creazione del protocollo descritto qui era di sviluppare una piattaforma di cultura di c. elegans che ha permesso per la selezione veloce di grandi librerie chimiche per nuovi composti biologicamente attivi. Mentre gli schermi chimici sono stati eseguiti prima dello sviluppo del presente protocollo, questi erano principalmente su piccola scala e/o tipo di candidato si avvicina2,3. Infatti, la maggior parte degli schermi eseguite in laboratorio su decine di composti utilizzati saggi di resistenza di sforzo, con colpi essere proiettati per longevità effetti4. Questo studio ha cercato invece di direttamente per effetti di durata della vita dello schermo. Notevolmente, c’erano poche descrizioni nella letteratura scientifica al momento dell’esecuzione di schermi chimico su larga scala con c. elegans. Infatti, rispetto ad altri tipi di schermi5,6,7, schermatura chimica su larga scala utilizzando c. elegans sembrava essere sotto-occupati.
C’erano due descrizioni di schermi chimico su larga scala in c. elegans che sono stati utilizzati come base per sviluppare questo approccio. Il primo di questi era un elegante studio da laboratorio di Peter Roy utilizzando schermi chimici per identificare i composti che potrebbero perturbare lo sviluppo degli animali. Lo studio poi seguiti con uno schermo di mutagenesi avanti identificare i bersagli genetici di questi prodotti chimici8. Il protocollo descritto in quello studio usato 24 pozzetti pates, che era semplicemente inattuabile per esigenze specifiche di questo studio (limitate quantità di prodotto chimico nella biblioteca e lo spazio limitato disponibile incubatrice). L’altro studio era innovativa e ambiziosa della piccolo-molecola a schermo di Michael Petrascheck per durata della vita estendendo prodotti chimici9,10. Tale studio ha utilizzato piastre da 384 pozzetti e colture liquide. L’altra caratteristica principale di questo schermo è stato l’uso di FUDR (5-fluorodeossiuridina) chimicamente inibizione della produzione di progenie. Dopo una notevole considerazione del protocollo descritto in quello studio, sterilizzazione chimica sia colture liquide di c. elegans sono stati evitati.
Sebbene FUDR è ampiamente usato negli esperimenti di durata della vita di c. elegans , c’erano preoccupazioni che FUDR potrebbe causare interazioni farmacologiche imprevisti, o che FUDR stesso può avere qualche effetto sulla durata della vita. Recentemente questa preoccupazione di quest’ultima è stata convalidata, almeno in alcune concentrazioni e in particolare a 25 ° C11. Per aggirare il problema della contaminazione di progenie, ceppo di c. elegans TJ1060 è stato usato, che ospita due mutazioni sensibili di temperatura indipendente (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) che abolire la produzione di spermatozoi e sono stati dimostrati per essere utile per le culture di massa di popolazioni sincrono12. Questo ceppo era completamente sterile a 25 ° C, ma produrrà progenie quando coltivate a 15-20 ° C. Questo studio ha usato condizioni di coltura convenzionale, con i vermi strisciando sulla superficie dell’agar, come i risultati ottenuti con colture liquide non sono sempre riproducibili con piastre di agar convenzionali. Mentre questo fenomeno completamente non è capito, è stato dimostrato che vermi coltivate nel liquido rispondere alla DR (restrizione dietetica) in maniera diversa rispetto vermi coltivate su supporti standard13,14. È pertanto plausibile che mezzi liquidi potrebbero mascherare alcuni mimetics DR che altrimenti sarebbe stato identificato con lo schermo.
Dopo aver depositato su condizioni di coltura agar, diverse opzioni per le prestazioni dei pozzi in questo test di punteggio sono stati considerati. Mentre varie analisi automatizzate o imaging base erano disponibili, hanno reso necessario acquisizione e distribuzione di tecnicamente impegnativi dispositivi, molte delle quali erano proibitivamente costosi. Pur considerando queste opzioni, era indispensabile fare riferimento alle schermate precedenti di durata della vita di tutti i tipi. In definitiva, questo studio ha usato un metodo segnante adattato dalla schermata di RNAi del Siu Sylvia Lee laboratorio intero genoma per durata della vita fenotipi15. In particolare, tutte le piastre di durata della vita sono state istituite nello stesso modo, ma solo controlli negativi sono stati controllati. Una volta che le piastre di controllo negativo sono state confermate per avere vicino completa mortalità, piastre di prova sono stati segnati a mano. In questa schermata su larga scala, aspetti positivi sono stati confermati da ri-test con prodotti chimici preparati al momento, utilizzando ripetizioni in triplice copia dei lati positivi di primari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto un metodo semplice per la coltura di c. elegans in piastre da 96 pozzetti. Descriviamo queste culture per screening chimico e saggi di durata della vita, ma possono essere utilizzati per molti tipi di analisi. Mentre condizioni di coltura multi-pozzetto per lo screening chimico precedentemente sono stati segnalati8, tra cui per durata della vita analisi10, il dosaggio descritto qui differisce in diversi modi. Il test di durata della vita qui descritto utilizza piastre da 96 pozzetti, si basa su mutanti sterili (invece di sterilizzazione chimica), utilizza condizioni di coltura agar, utilizza i componenti liquidi semplici per spostare il worm e manualmente viene segnato all’endpoint. I diversi approcci utilizzati in questo test possono essere di aiuto ai ricercatori alla ricerca di metodi che includono queste condizioni di screening.
Elementi cruciali per questo protocollo centro principalmente sulla qualità delle lastre prodotte per il dosaggio. In primo luogo, quando si effettuano piatti è imperativo che la superficie dell’agar è priva di bolle e altre imperfezioni. Queste variazioni nella superficie dell’agar quasi sempre portano a scavare e perdita del pozzo. In secondo luogo, questo protocollo si basa su l’asciugatura dei liquidi depositati durante le fasi di installazione e drogare. È fondamentale che questi liquidi vengono rimossi completamente, ma l’agar non diventare seccava. Aneddoticamente, sembra che vermi nei pozzi che non sono completamente asciutto (nuoto in liquido) vivono più a lungo di pozzi correttamente essiccati, mentre sopra-essiccamento delle piastre porta ad essiccamento e screpolature dell’agar, che conduce a vite senza fine scavando e perdita. Un altro elemento cruciale del presente protocollo è mantenere condizioni di sterilità. Come con qualsiasi test di durata della vita, c’è un sacco di lavoro coinvolti con la piastra di supporto, e molte opportunità e tempo esiste per dosaggio rovinando la contaminazione per insediarsi e crescere sulle piastre.
Mentre il test di durata della vita qui descritto è utile per lo screening di composti in c. elegans, è limitata a particolari ambiti di provenienza genetici, quanto si basa su un ceppo sterile temperatura sensibile (ts); Abbiamo usato TJ1060, che ha penetranza elevata sterilità. Questo limita i ceppi disponibili per lo screening con questo metodo. I metodi alternativi tra cui attraversando ts sterile mutazioni nello sfondo desiderato o mediante sterilizzazione chimica. Non abbiamo provato la sterilizzazione chimica con questo test, ma dovrebbe essere possibile. Potenziali ostacoli riguardano la collocazione dello sterilizzatore sui vermi nella fase corretta e nella dose corretta. Il protocollo descritto qui usa un dispenser liquido che è veloce, ma non viene visualizzato per erogare efficacemente gli adulti. Così, questi vermi si sviluppano le piastre e pertanto devono essere trattati con la sterilizzazione chimica sulle piastre. Determinare la dose ottima e la tempistica sarebbe importante per il successo. Strategie alternative includono l’utilizzo di un metodo di erogazione che possa spostare gli adulti. In passato, abbiamo trovato che le macchine in grado di identificare e ordinare gli adulti sono generalmente molto più lenti rispetto i gestori liquidi semplici, che possono erogare fanghi omogenee della larva sospesa.
In generale, usiamo questo metodo rapidamente schermo prodotti chimici e trattamenti per grandi effetti positivi sulla durata della vita. Il metodo è particolarmente efficace se usato con dosi multiple, alta replicare i numeri e un attento controllo di controlli negativi che sono sempre mantenuti e intercalati tra le piastre di prova. Controlli positivi sono anche utili nel definire e attuare le schermate descritte in questo manoscritto. Tuttavia, per essere un efficace positivo, il controllo avrebbe bisogno di essere abbastanza potente e/o estremamente robusto. Quando lo schermo è stato originariamente distribuito, non è stato identificato un composto adeguatamente potente e robusto. Attualmente, ci sono molti rapporti nella letteratura ‘invecchiamento’ di probabili candidati per controlli positivi utili nelle schermate descritte qui. Come descritto nella sezione screen candidato della sezione risultati attesi di questo manoscritto e nella Figura 2 e tabella 1, il composto NP1 è un efficace controllo positivo per questo schermo. Confermiamo generalmente risultati positivi da questi schermi con vita utile standard saggi su piastre di coltura di 3 mm.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Dipa Bhaumik, Aaron Miller e Bob Hughes per assistenza tecnica. Ceppi sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall’ufficio di NIH di programmi di ricerca dell’infrastruttura (P40 OD010440). Siamo grati a Georgia boschi e membri di Lithgow, Kapahi e Melov Labs per utili discussioni. M.L. era sostenuto da National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 AG000266 e un Ellison medica Foundation/American Federation of invecchiamento ricerca induttrici Fellowship. Quest’opera è stata sostenuta da una sovvenzione BioAge Labs, una sovvenzione di Larry L. Hillblom Foundation, così come i National Institutes of Health concede UL1024917, supportano il Consorzio di ricerca interdisciplinare su Geroscience e 1R01AG029631-01A1 a G.J.L.
Materials
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
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