Summary

Создание высокопроизводительного скрининга платформы для оценки гетерогенности амплификации гена HER2 в опухоли молочной железы

Published: December 05, 2017
doi:

Summary

Гетерогенные распределение HER2-положительных клеток может наблюдаться в подмножестве рака груди и генерирует клинических дилеммы. Здесь мы представляем надежные и рентабельные протокол определить, количественно оценить и сравнить HER2 генетической гетерогенностью внутри опухоли в большой серии гетерогенно переработки молочной железы.

Abstract

Целевые терапии против человека эпидермального фактора роста рецепторов 2 (HER2) радикально изменили результаты у пациентов с раком груди HER2-положительных. Однако меньшинство случаев выводит гетерогенных распределение HER2-положительных клеток, который генерирует основных клинических проблем. На сегодняшний день, были предложены не надежных и стандартизированных протоколов для характеристик и количественной оценки HER2 гетерогенных амплификации генов в большой когорты. Здесь мы представляем высок объём методологии одновременно оценить HER2 статуса в различных топографических областях несколько случаев рака молочной железы. В частности мы иллюстрируем лабораторные процедуры для создания расширенной ткань microarrays (TMAs) Включение целевых сопоставление опухолей. Все параметры TMA был специально оптимизирован для серебра в situ гибридизация (SISH) формалин Исправлена парафин врезанных тканей молочной железы (FFPE). Иммуногистохимический анализ прогностические и интеллектуального биомаркеров (то есть, ER, PR, Ki67 и HER2) должны выполняться с помощью автоматизированных процедур. Настроить протокол SISH была выполнена разрешить высокого качества молекулярного анализа через нескольких тканей, которые прошли различные процедуры фиксации, обработки и хранения. В этом исследовании мы предоставляем доказательство из принцип что специфических последовательностей ДНК может быть одновременно локализованы в отдельных областях Топографическая множественных и гетерогенно обработанные молочной железы с использованием метода эффективной и рентабельной.

Introduction

HER2 является протоонкоген, оверэкспрессировали и в 15-30% всех инвазивных груди Рак1,2. Гиперэкспрессия HER2 определяется наличием > 10% клеток с сильным мембраны иммуногистохимический (IHC) окрашивание (3 +), в то время как амплификации генов могут быть оценены когда либо соотношение HER2/центромер ≥2 или номер копии гена ≥6, на подсчет голосов на наименее 20 клеток в situ гибридизация (ISH)3.

Генетической гетерогенностью внутри опухоль была широко описана в молочной железы, потенциально неблагоприятных вклад биомаркеров оценки и лечения ответ4. Согласно колледж американских патологов (CAP), неоднородность HER2 существует если HER2 усиливается в > 5% и < 50% проникновения опухолевых клеток5. К сожалению фактическая заболеваемость пространственной гетерогенности рака груди HER2 остается предметом споров среди патологоанатомов, с некоторыми авторами, что поддержание это событие чрезвычайно редки, и другие о том, что до 40% случаев HER2-гетерогенных1,5,6,,78,9,10. Несмотря на биологические механизмы, лежащие в основе этого состояния не еще полностью уточняются, прогностические и клинических последствий неоднородности HER2 интра опухоли имеют решающее значение для больных раком молочной железы11.

Недавно ярко поле молекулярные методы, такие как хромогенных иш (CISH) и серебряные иш (SISH), появились как надежные методы для обнаружения HER2 гетерогенность в FFPE тканях, с некоторыми преимуществами по сравнению с флуоресцентные иш (рыба)12. К сожалению массового анализа единичных случаях остается непрактичным в больших когортных исследований. Несколько групп показали, что сочетание гистохимии, МХК и ISH с ТМА технологий может представлять ценные стратегии в исследовании рака биологии13,14,,1516. С этого широко распространенного метода образцы ткани из разных пациентов могут быть проанализированы одновременно, минимизации ткани и реагентов, используемых и способствуя единообразного анализа большой серии случаев14. Однако без протоколы доступны для одновременного высок объём молекулярные характеристики нескольких образцов тканей, которые прошли различные обработки с точки зрения реагентов, фиксации времени и методы сохранения занятости, таких как архивные блоки.

Учитывая прогностические и клинические последствия HER2 Пространственная гетерогенность рака молочной железы, мы разработали комплексную платформу молекулярной оценить его в большой серии гетерогенно переработанных случаев. Здесь мы изобразить Лаборатория стратегии для создания и анализа гетерогенности интра опухоль HER2 амплификации в высокодоходные TMAs рака молочной железы с помощью SISH. Следующий протокол был разработан для измерения опухоли > 5 мм (> pT1b согласно TNM 2017)17. Для небольших повреждениях мы рекомендуем проведение анализа на анфас последовательных участках. Наша процедура позволяет для одновременного анализа IHC и SISH рака груди до 30, охватывающих означает 6 различных областей (диапазон 4-8) для каждого случая. В общей сложности 180 сердечников ткани 1 мм в диаметре, с 500 мкм между ядрами и 2 мм между краями сетки и будет создаваться для каждого ТМА блока.

Protocol

Это исследование было одобрено институциональные наблюдательные советы от IRCCS Ca’ Granda фонд, больницы Поликлинико, Милан, Италия. 1. подбор больных и образцы тканей Извлечения архивных слайды всех случаев для анализа, включая все доступные гематоксилином и эозином (H & E…

Representative Results

В целом, 444 инвазивных молочной железы, рака были включены в 15 TMAs, специально оптимизированный для анализа иш. Среди отобранных 2,664 пятна 2,651 (99,5%) были представитель ранее выделенных областей и поэтому считается поддаются для последующего анализа. Интра опухоль гетерог?…

Discussion

Здесь мы подробно стратегии лаборатории для выполнения анализов SISH гена HER2 и его соответствующий центромер в высокодоходные TMAs гетерогенно переработки молочной железы. Этот метод является экономически эффективным и может осуществляться в большинстве лабораторий для исследован…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Нет.

Materials

Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26×76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device – digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. ‘Genetic heterogeneity’ in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies – a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Play Video

Cite This Article
Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

View Video