Создание высокопроизводительного скрининга платформы для оценки гетерогенности амплификации гена HER2 в опухоли молочной железы
Summary
Гетерогенные распределение HER2-положительных клеток может наблюдаться в подмножестве рака груди и генерирует клинических дилеммы. Здесь мы представляем надежные и рентабельные протокол определить, количественно оценить и сравнить HER2 генетической гетерогенностью внутри опухоли в большой серии гетерогенно переработки молочной железы.
Abstract
Целевые терапии против человека эпидермального фактора роста рецепторов 2 (HER2) радикально изменили результаты у пациентов с раком груди HER2-положительных. Однако меньшинство случаев выводит гетерогенных распределение HER2-положительных клеток, который генерирует основных клинических проблем. На сегодняшний день, были предложены не надежных и стандартизированных протоколов для характеристик и количественной оценки HER2 гетерогенных амплификации генов в большой когорты. Здесь мы представляем высок объём методологии одновременно оценить HER2 статуса в различных топографических областях несколько случаев рака молочной железы. В частности мы иллюстрируем лабораторные процедуры для создания расширенной ткань microarrays (TMAs) Включение целевых сопоставление опухолей. Все параметры TMA был специально оптимизирован для серебра в situ гибридизация (SISH) формалин Исправлена парафин врезанных тканей молочной железы (FFPE). Иммуногистохимический анализ прогностические и интеллектуального биомаркеров (то есть, ER, PR, Ki67 и HER2) должны выполняться с помощью автоматизированных процедур. Настроить протокол SISH была выполнена разрешить высокого качества молекулярного анализа через нескольких тканей, которые прошли различные процедуры фиксации, обработки и хранения. В этом исследовании мы предоставляем доказательство из принцип что специфических последовательностей ДНК может быть одновременно локализованы в отдельных областях Топографическая множественных и гетерогенно обработанные молочной железы с использованием метода эффективной и рентабельной.
Introduction
HER2 является протоонкоген, оверэкспрессировали и в 15-30% всех инвазивных груди Рак1,2. Гиперэкспрессия HER2 определяется наличием > 10% клеток с сильным мембраны иммуногистохимический (IHC) окрашивание (3 +), в то время как амплификации генов могут быть оценены когда либо соотношение HER2/центромер ≥2 или номер копии гена ≥6, на подсчет голосов на наименее 20 клеток в situ гибридизация (ISH)3.
Генетической гетерогенностью внутри опухоль была широко описана в молочной железы, потенциально неблагоприятных вклад биомаркеров оценки и лечения ответ4. Согласно колледж американских патологов (CAP), неоднородность HER2 существует если HER2 усиливается в > 5% и < 50% проникновения опухолевых клеток5. К сожалению фактическая заболеваемость пространственной гетерогенности рака груди HER2 остается предметом споров среди патологоанатомов, с некоторыми авторами, что поддержание это событие чрезвычайно редки, и другие о том, что до 40% случаев HER2-гетерогенных1,5,6,,78,9,10. Несмотря на биологические механизмы, лежащие в основе этого состояния не еще полностью уточняются, прогностические и клинических последствий неоднородности HER2 интра опухоли имеют решающее значение для больных раком молочной железы11.
Недавно ярко поле молекулярные методы, такие как хромогенных иш (CISH) и серебряные иш (SISH), появились как надежные методы для обнаружения HER2 гетерогенность в FFPE тканях, с некоторыми преимуществами по сравнению с флуоресцентные иш (рыба)12. К сожалению массового анализа единичных случаях остается непрактичным в больших когортных исследований. Несколько групп показали, что сочетание гистохимии, МХК и ISH с ТМА технологий может представлять ценные стратегии в исследовании рака биологии13,14,,1516. С этого широко распространенного метода образцы ткани из разных пациентов могут быть проанализированы одновременно, минимизации ткани и реагентов, используемых и способствуя единообразного анализа большой серии случаев14. Однако без протоколы доступны для одновременного высок объём молекулярные характеристики нескольких образцов тканей, которые прошли различные обработки с точки зрения реагентов, фиксации времени и методы сохранения занятости, таких как архивные блоки.
Учитывая прогностические и клинические последствия HER2 Пространственная гетерогенность рака молочной железы, мы разработали комплексную платформу молекулярной оценить его в большой серии гетерогенно переработанных случаев. Здесь мы изобразить Лаборатория стратегии для создания и анализа гетерогенности интра опухоль HER2 амплификации в высокодоходные TMAs рака молочной железы с помощью SISH. Следующий протокол был разработан для измерения опухоли > 5 мм (> pT1b согласно TNM 2017)17. Для небольших повреждениях мы рекомендуем проведение анализа на анфас последовательных участках. Наша процедура позволяет для одновременного анализа IHC и SISH рака груди до 30, охватывающих означает 6 различных областей (диапазон 4-8) для каждого случая. В общей сложности 180 сердечников ткани 1 мм в диаметре, с 500 мкм между ядрами и 2 мм между краями сетки и будет создаваться для каждого ТМА блока.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы подробно стратегии лаборатории для выполнения анализов SISH гена HER2 и его соответствующий центромер в высокодоходные TMAs гетерогенно переработки молочной железы. Этот метод является экономически эффективным и может осуществляться в большинстве лабораторий для исследован…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Нет.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
References
- Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
- Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
- Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
- Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
- Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
- Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
- Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
- Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. ‘Genetic heterogeneity’ in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
- Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
- Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
- Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
- Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
- Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
- Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies – a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
- Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
- Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
- Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
- Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
- Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
- Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
- Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
- Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
- De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).
