Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama
Summary
Distribuição heterogênea de células HER2-positivo pode ser observada em um subconjunto dos cancros da mama e gera dilemas clínicas. Aqui, apresentamos um protocolo confiável e econômico para definir, quantificar e comparar a heterogeneidade genética de HER2 intra-tumor em uma grande série de cancros da mama de forma heterogénea transformados.
Abstract
Terapias alvo contra o receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2 mudaram radicalmente os resultados dos pacientes com câncer de Mama HER2-positivo. No entanto, uma minoria de casos exibe uma distribuição heterogênea de células HER2-positivo, que gera grandes desafios clínicos. Até à data, não há protocolos confiáveis e padronizados para a caracterização e quantificação de amplificação de gene HER2 heterogênea em grandes coortes têm sido propostos. Aqui, apresentamos uma metodologia de alta produtividade para avaliar simultaneamente o status HER2 em diferentes áreas topográficas de vários cancros da mama. Em particular, ilustramos o procedimento laboratorial para construir aprimorado os microarrays do tecido (TMAs) incorporando um mapeamento alvo dos tumores. Todos os parâmetros TMA foram otimizados especificamente para a prata em situ da hibridação (SISH) de formalina-parafina (FFPE) mama tecidos fixados. Análise imunohistoquímica de biomarcadores os prognósticos e preditivos (isto é, ER, PR, Ki67 e HER2) deve ser realizada utilizando procedimentos automatizados. Um protocolo personalizado de SISH foi implementado para permitir uma análise molecular de alta qualidade através de vários tecidos que passou por diferentes procedimentos de fixação, processamento e armazenamento. Neste estudo, nós fornecemos um prova de princípio que sequências específicas de DNA pode ser câncer de mama de forma heterogénea transformados e simultaneamente localizadas em áreas topográficas distintas de múltiplos usando um método eficiente e econômico.
Introduction
HER2 é um proto-oncogene que é overexpressed e amplificado em 15-30% de mama invasivo todos os cancros1,2. Superexpressão de HER2 é inferido pela presença de > 10% células com membrana forte imuno-histoquímica (IHC) coloração (3 +), enquanto a amplificação do gene pode ser avaliada quando a proporção de HER2/Centrómero é ≥2 ou o número de cópia do gene é ≥ 6, na contagem de pelo menos 20 células por em situ da hibridação (ISH)3.
Heterogeneidade genética intra-tumor tem sido amplamente descrita em cânceres de mama, sendo um contribuinte potencialmente adverso para avaliação de biomarcadores e tratamentos resposta4. De acordo com a faculdade de americana patologistas (CAP), HER2 heterogeneidade existe se HER2 é amplificado em > 5% e < 50% do tumor infiltrando-se células5. Lamentavelmente, a incidência real da heterogeneidade espacial HER2 no câncer de mama continua a ser um assunto de controvérsia entre os patologistas, com alguns autores de manutenção que é um evento extremamente raro e outros, sugerindo que até 40% dos casos são HER2-heterogêneos1,5,6,7,8,9,10. Apesar dos mecanismos biológicos subjacentes a esta condição não são ainda totalmente esclarecido, os impactos clínicos e prognósticos da heterogeneidade de HER2 intra-tumor são cruciais para a de pacientes de câncer de mama11.
Recentemente, técnicas moleculares brilhante-campo, tais como o cromogênico ISH (CISH) e prata ISH (SISH), têm emergido como métodos confiáveis para detectar heterogeneidade HER2 em tecidos FFPE, com algumas vantagens em comparação com fluorescente ISH (FISH)12. Lamentavelmente, a análise em massa dos casos simples continua a ser impraticável em estudos de coorte-grande investigação. Vários grupos têm sugerido que a combinação da histoquímica, IHC e ISH com tecnologias TMA poderia representar uma estratégia valiosa no estudo de câncer biologia13,14,15,16. Com este método amplamente adotado, amostras de tecido de diferentes pacientes analisáveis simultaneamente, minimizando o tecido e os reagentes empregados e, assim, fomentar a análise uniforme de uma grande série de casos14. No entanto, não há protocolos estão disponíveis para a caracterização molecular de elevado-produção simultânea de múltiplas amostras de tecido que foram submetidos a diferentes de processamento em termos de reagentes, tempos de fixação e métodos de conservação empregados, tais como arquivamento blocos.
Tendo em conta as implicações clínicas e prognósticos da heterogeneidade espacial HER2 no câncer de mama, desenvolvemos uma plataforma integrada de molecular para avaliá-la em grande série de casos de forma heterogénea transformados. Aqui, podemos retratar as estratégias de laboratório para gerar e analisar a heterogeneidade intra-tumor de amplificação do HER2 em alto rendimento TMAs do câncer de mama por meio de SISH. O protocolo a seguir foi desenvolvido para medir os tumores > 5 mm (> pT1b de acordo com o TNM 2017)17. Para lesões menores, recomendamos realizar a análise em seções seriais Full-face. Nosso processo permite a análise simultânea de IHC e SISH até 30 dos cancro da mama, englobando uma média de 6 áreas distintas (intervalo de 4-8) para cada caso. No total, 180 núcleos de tecido de 1 mm de diâmetro, com 500 µm entre os núcleos e 2 mm entre a grade e bordas serão gerados para cada bloco TMA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, temos as estratégias de laboratório para realizar análises SISH do gene HER2 e sua correspondente Centrómero em alto rendimento TMAs dos cancros da mama de forma heterogénea transformados detalhados. Este método é econômico e pode ser realizado na maioria dos laboratórios para o estudo da heterogeneidade de amplificação do gene HER2 em grandes coortes de mama câncer obtida forma patologia archives.
Devido a importância clínica do HER2 testes em câncer de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
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