Het opbouwen van een High-throughput Screening Platform te beoordelen van de heterogeniteit van de HER2-gen Amplification in kanker van de borst

HER2 is een oncogen dat overexpressie en versterkt in 15-30% van alle invasieve borst kanker^1,2. HER2 overexpressie is afgeleid door de aanwezigheid van > 10% cellen met sterke membraan immunohistochemische (IHC) kleuring (3 +), terwijl de versterking van het gen kan worden beoordeeld wanneer de verhouding van de HER2/centromeer ≥2 is ofwel dat het exemplaaraantal gene ≥6, op te tellen bij minste 20 cellen door in situ hybridisatie (ISH)³.

Intra-tumor genetische heterogeniteit is wijd beschreven in kanker van de borst, wordt een potentieel negatieve bijdrage aan de evaluatie van biomarkers en behandelingen reactie⁴. Volgens het College van Amerikaanse pathologen (GLB), HER2 heterogeniteit bestaat als HER2 wordt versterkt > 5% en < 50% van het infiltreren van tumor cellen⁵. Helaas, de werkelijke incidentie van HER2 ruimtelijke heterogeniteit in kanker van de borst blijft een onderwerp van controverse tussen de pathologen, met sommige auteurs onderhouden dat het is een uiterst zeldzaam evenement en anderen suggereren dat tot 40% van de gevallen zijn HER2-heterogene^{1,5,6,7,8,9,10}. Ondanks de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarde zijn niet nog volledig opgehelderd, de prognostische en klinische effecten van intra-tumor HER2 heterogeniteit zijn cruciaal voor borst kanker patiënten¹¹.

Onlangs, helder-veld moleculaire technieken, zoals chromogenic ISH (CISH) en zilveren ISH (SISH), opgedoken als betrouwbare methoden voor het detecteren van HER2 heterogeniteit in FFPE weefsels, met een aantal voordelen ten opzichte van TL ISH (vis)¹². Helaas blijft de bulk analyse van individuele gevallen onpraktisch in groot-cohort onderzoeken. Verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de combinatie van histochemie, IHC en ISH met TMA technologieën een waardevolle strategie in de studie van biologie van kanker^{13,14,15,16 vertegenwoordigen kan}. Met deze wijd goedgekeurde methode kunnen weefselmonsters van verschillende patiënten worden geanalyseerd gelijktijdig, minimaliseren van de weefsels en reagentia werkzaam en daardoor de bevordering van de uniforme analyse van een groot aantal gevallen¹⁴. Er zijn echter geen protocollen beschikbaar voor de gelijktijdige hoog-productie moleculaire karakterisering van meerdere weefselmonsters die onderging verschillende verwerking in termen van reagentia, fixatie tijden en conserveringsmethoden werknemer, bijvoorbeeld als archivering blokken.

Gezien de prognostische en klinische implicaties van HER2 tot ruimtelijke heterogeniteit in borstkanker, ontwikkelden we een geïntegreerde moleculaire platform om te beoordelen in grote reeks ongelijkmatig verwerkte gevallen. Hier, schilderen we de laboratorium-strategieën om te genereren en analyseren van de intra-tumor heterogeniteit van versterking van de HER2 in high yield TMAs van borstkanker door middel van SISH. Het volgende protocol is ontwikkeld voor tumoren meten van > 5 mm (> pT1b volgens het TNM-2017)¹⁷. Voor kleinere letsels, is het aan te raden de analyses uitvoeren met full-face seriële secties. Onze procedure zorgt voor de gelijktijdige IHC en SISH analyse van maximaal 30 kanker van de borst, met een gemiddelde van 6 vlakken (bereik 4-8) voor elk geval. Over het geheel genomen zal 180 weefsel kernen van 1 mm in diameter, met 500 µm tussen de kernen, en 2 mm tussen het raster en de randen worden gegenereerd voor elk TMA-blok.