בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד
Summary
הטרוגניות חלוקת תאים HER2 חיובי יכול להיות שנצפו בקבוצת משנה של סרטן השד ומייצר דילמות קליניים. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול אמין וחסכוני להגדיר, לכמת, ולהשוות בין HER2 אינטרה-גידול הטרוגניות גנטית בסדרה גדולה של סרטן השד heterogeneously מעובד.
Abstract
טיפולים ממוקדים כנגד הקולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס 2 (HER2) השתנו באופן קיצוני את התוצאה של חולים עם סרטן השד HER2 חיובי. עם זאת, מיעוט מהמקרים הצגת התפלגות הטרוגנית של HER2 חיובי תאים, אשר יוצר אתגרים קליניים גדולים. נכון להיום, אין פרוטוקולים סטנדרטיים ואמין כדי להפוך את אפיון כימות של HER2 הטרוגנית הגברה ג’ין קוהורטות גדולות הוצעו. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה תפוקה גבוהה להעריך את מצב HER2 בו זמנית על פני אזורים שונים טופוגרפית של סרטן השד מרובים. בפרט, אנו ממחישים את ההליך מעבדה כדי לבנות מיקרו-מערכים רקמות משופרת (ניסית אותו בעבר) שילוב מיפוי יישוב של הגידולים. כל הפרמטרים TMA מוטבו במיוחד עבור כסף בחיי עיר הכלאה (SISH) של פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) רקמות השד. ניתוח Immunohistochemical של סמנים prognostic, ניבוי (קרי, ER, יחסי ציבור, Ki67 ו- HER2) צריכה להתבצע באמצעות הליכים אוטומטיים. פרוטוקול SISH מותאם אישית יושמה כדי לאפשר ניתוח מולקולרית באיכות גבוהה על פני מספר רקמות שעברו הליכים קיבעון, עיבוד, אחסון שונים. במחקר זה, אנו מספקים הוכחה-של-עיקרון כי רצפי DNA ספציפיים יכול להיות סרטן שד מקומי בו זמנית באזורים סימון שבילים ברורים של מרובה ולא מעובד heterogeneously באמצעות שיטה יעילה וחסכונית.
Introduction
HER2 נמצא proto-oncogene overexpressed, הוגדל ב- 15-30%1,סרטן שד פולשני כל2. HER2 ביטוי היא להסיק על ידי הנוכחות של > 10% תאים עם ממברנה חזקה immunohistochemical (IHC) צביעת (3 +), בעוד הגברה ג’ין יכול להידרש כאשר היחס HER2/צנטרומר הוא ≥2 או המספר עותק הגן הוא ≥6, כאשר על סופר לפחות 20 תאים על-ידי בחיי עיר הכלאה (איש)3.
הטרוגניות גנטית אינטרה-הגידול כבר נרחב שמתואר סרטן השד, להיות תורם פוטנציאלי לוואי הערכת סמנים ביולוגיים ו טיפולים תגובה4. על פי המכללה של אמריקאי פתולוגים (CAP), HER2 הטרוגניות קיימת אם HER2 מוגבר ב- > 5% ו- < 50% שחדר גידול תאים5. למרבה הצער, השכיחות האמיתית של HER2 הטרוגניות המרחבי סרטן שד נותרת כנושא למחלוקת בין פתולוגים עם יש מחברים שמירה על זה זהו אירוע נדיר ביותר, מציע את זה עד 40% של המקרים האחרים HER2-הטרוגניות1,5,6,7,8,9,10. למרות המנגנונים הביולוגיים לחזק תנאי זה לא עדיין מלא לאשורן, ההשפעות prognostic וקלינית של הטרוגניות HER2 אינטרה-גידול מכריעים עבור חולי סרטן השד11.
לאחרונה, טכניקות מולקולריות שדה בהיר, כגון הדפסות כסף איש (CISH) וכסף איש (SISH), הופיעו כפעולות אמין כדי לזהות HER2 הטרוגניות ברקמות FFPE, עם כמה יתרונות לעומת איש (פיש) פלורסנט12. למרבה הצער, ניתוח בכמות גדולה של מקרים בודדים נשאר מעשית בלימודי מחקר עוקבה גדול. מספר קבוצות הראו כי השילוב של להסטולוגיה, IHC ולאחר איש עם טכנולוגיות TMA יכול לייצג אסטרטגיה חשוב בחקר הסרטן ביולוגיה13,14,15,16. בשיטה זו אומץ באופן נרחב, דגימות רקמות מחולים שונים ניתן לנתח אותם במקביל, מזעור של רקמות, ריאגנטים המועסקים וטיפוח ובכך ניתוח אחיד של סדרה גדולה של מקרים14. עם זאת, אין פרוטוקולים זמינים עבור סימולטני תפוקה גבוהה מולקולרית אפיון דגימות רקמה מרובים שעברו שונים עיבוד במונחים של ריאגנטים, קיבוע פעמים ושיטות שימור מועסקים, כגון כמו ארכיון בלוקים.
לאור ההשלכות prognostic וקלינית של הטרוגניות המרחבי HER2 סרטן שד, פיתחנו פלטפורמה מולקולרית משולבת כדי להעריך את זה בסדרה גדולה של מקרים heterogeneously מעובד. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיות מעבדה ליצור ולנתח את הטרוגניות אינטרה-גידול של HER2 הגברה ניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד באמצעות SISH. הפרוטוקול הבא פותחה עבור גידולים מדידה > 5 מ מ (> pT1b על פי 2017 TNM)17. עבור נגעים קטנים יותר, אנו ממליצים על ביצוע הניתוח על עטיית מקטעים טורי. את הנהלים שלנו מאפשר ניתוח IHC ולאחר SISH בו זמנית של עד 30 סרטן השד, המקיף ממוצע של 6 תחומים ברורים (טווח 4-8) עבור כל מקרה. בסך הכל, 180 ליבות רקמות של 1 מ מ קוטר, עם 500 מיקרומטר בין הליבות, 2 מ מ בין הרשת לבין קצוות ייווצר עבור כל בלוק TMA.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, שתוארו האסטרטגיות מעבדה לביצוע ניתוחים SISH של הגן HER2 ו שלה צנטרומר המתאימה בניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד heterogeneously מעובד. שיטה זו היא חסכונית, יכול להתבצע במעבדות רוב לצורך המחקר של HER2 הטרוגניות ג’ין הגברה ב קוהורטות גדולות של השד סרטן לאחזר טופס פתולוגיה ארכיונים….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. לא-
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
References
- Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
- Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
- Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
- Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
- Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
- Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
- Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
- Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. ‘Genetic heterogeneity’ in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
- Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
- Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
- Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
- Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
- Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
- Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies – a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
- Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
- Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
- Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
- Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
- Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
- Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
- Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
- Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
- De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).
