Summary

Construcción de una plataforma de proyección de alto rendimiento para evaluar la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 en cáncer de mama

Published: December 05, 2017
doi:

Summary

Distribución heterogénea de células HER-2 positivo se puede observar en un subgrupo de cánceres de mama y genera dilemas clínicos. Aquí, presentamos un protocolo fiable y rentable para definir, cuantificar y comparar la heterogeneidad genética de la intra-tumor HER2 en una serie grande de los cánceres de mama heterogéneo procesados.

Abstract

Terapias dirigidas contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) han cambiado radicalmente el resultado de pacientes con cáncer de mama positivo para HER2. Sin embargo, una minoría de casos muestra una distribución heterogénea de células HER-2 positivo, que genera grandes desafíos clínicos. Hasta la fecha, no hay protocolos confiables y estandarizados para la caracterización y cuantificación de la amplificación del gen HER2 heterogénea en grandes cohortes se han propuesto. Aquí, presentamos una metodología de alto rendimiento para evaluar simultáneamente el estado de HER2 en diferentes áreas topográficas de múltiples cánceres de mama. En particular, nos ilustran el procedimiento de laboratorio para la construcción de microarreglos de tejido mejorado (TMAs) incorporando una asignación específica de los tumores. Todos los parámetros de TMA se han optimizado específicamente para la plata en situ hibridación (SISH) de formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) tejidos del pecho. El análisis de Immunohistochemical de los biomarcadores pronósticos y predictivos (es decir, ER, PR, Ki67 y HER2) debe realizarse mediante los procedimientos automatizados. Se ha implementado un protocolo personalizado de SISH para permitir un análisis molecular de alta calidad a través de múltiples tejidos que experimentaron diferentes procedimientos de fijación, procesamiento y almacenamiento. En este estudio, le ofrecemos una prueba de principio que secuencias específicas de ADN podrían ser cánceres localizados simultáneamente en distintas zonas topográficas de múltiple y heterogéneo procesados usando un método eficiente y rentable.

Introduction

HER2 es un proto-oncogene que se sobreexpresa y amplificado en 15-30% de todos cánceres de mama invasivo1,2. Sobreexpresión de HER2 se infiere por la presencia de > 10% células con membrana fuerte inmunohistoquímica (IHC) tinción (3 +), mientras que la amplificación del gen pueden ser evaluada cuando el número de copias del gen es ≥6, o el HER2/centrómero es ≥ 2 en el recuento en por lo menos 20 células por en situ hibridación (ISH)3.

Heterogeneidad genética intra-tumor ha sido ampliamente descrito en los cánceres de mama, siendo un colaborador potencialmente adverso para la evaluación de biomarcadores y tratamientos respuesta4. Según el Colegio de patólogos americanos (CAP), HER2 heterogeneidad existe si HER2 está amplificado en > 5% y < 50% del tumor de la infiltración de las células5. Lamentablemente, la incidencia real de la heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama sigue siendo un tema de controversia entre patólogos, con algunos autores mantienen es un evento extremadamente raro, y otros que sugieren que hasta un 40% de los casos son HER2-heterogénea1,5,6,7,8,9,10. A pesar de los mecanismos biológicos que sostienen esta condición no son todavía completamente aclarado, los impactos clínicos y pronósticos de la heterogeneidad de HER2 del tumor intra son cruciales para el de pacientes de cáncer de mama11.

Recientemente, técnicas moleculares de campo brillante, como ISH cromogénica (CISH) y ISH plata (SISH), han surgido como métodos confiables para detectar heterogeneidad de HER2 en los tejidos FFPE, con algunas ventajas en comparación con a fluorescente ISH (pescado)12. Lamentablemente, el análisis de a granel de casos individuales sigue siendo poco práctico en estudios de grandes cohortes. Varios grupos han sugerido que la combinación de histoquímica, IHC y ISH con tecnologías TMA podría representar una estrategia valiosa en el estudio de cáncer biología13,14,15,16. Con este método ampliamente adoptado, las muestras de tejido de diferentes pacientes pueden analizarse al mismo tiempo, minimizar el tejido y los reactivos empleados y así fomentar el análisis uniforme de una serie grande de casos14. Sin embargo, no hay protocolos están disponibles para la caracterización molecular simultánea de alto rendimiento de múltiples muestras de tejido que experimentó diferentes de procesamiento en cuanto a reactivos, fijación de tiempos y métodos de conservación empleados, tales como archivo bloques.

Dada las implicaciones clínicas y pronósticas de heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama, hemos desarrollado una plataforma integrada de molecular para evaluar en series grandes de casos procesados heterogéneo. Aquí, describen las estrategias de laboratorio para generar y analizar la heterogeneidad intra-tumor de amplificación de HER2 en TMAs de alto rendimiento de cáncer de mama por medio de SISH. El siguiente protocolo ha sido desarrollado para medir los tumores > 5 mm (> pT1b según el TNM 2017)17. Para lesiones más pequeñas, se recomienda realizar el análisis en las secciones seriales Full-Face. Nuestro procedimiento permite el análisis simultáneo de la IHC y SISH de hasta 30 cáncer de mama, que abarca una media de 6 zonas diferenciadas (rango 4-8) para cada caso. En conjunto, se generarán 180 núcleos de tejido de 1 mm de diámetro, con 500 μm entre los núcleos y de 2 mm entre la cuadrícula y los bordes de cada bloque TMA.

Protocol

Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de IRCCS Ca’ Granda Fundación, Hospital Policlínico, Milán, Italia. 1. selección de pacientes y muestras de tejido Recuperar el archivo diapositivas de todos los casos a ser analizados, incluyendo todas las disponible hematoxilina y eosina (H & E) y diapositivas IHC de la diagnosis original y, si está presente, un H & E de emparejar el tejido mamario no neoplásicas (p. ej., margen quirúrgico) . …

Representative Results

En general, 444 mama invasivo cáncer se incorporaron 15 TMAs optimizados específicamente para análisis ISH. Entre los 2.664 puntos muestreados, 2.651 (99.5%) eran representativos de las áreas previamente seleccionadas y por lo tanto se considera favorable para análisis posteriores. Heterogeneidad intra-tumor se determinó por medio de IHC y SIH, con un enfoque particular sobre la heterogénea distribución de clones de HER2-positivo en las distintas áreas topográficas de los tumore…

Discussion

Aquí, hemos detallado las estrategias de laboratorio para realizar análisis SISH del gene HER2 y su centrómero correspondiente en TMAs de alto rendimiento de cánceres de mama heterogéneo procesados. Este método es rentable y puede llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios para el estudio de la heterogeneidad de amplificación del gen HER2 en cohortes grandes de los archivos de patología de mama cáncer obtenido forma.

Debido a la importancia clínica de HER2 e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ninguno.

Materials

Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26×76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device – digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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