بناء منصة فرز الفائق لتقييم عدم تجانس التضخيم الجين HER2 في سرطان الثدي
Summary
التوزيع غير متجانسة من الخلايا إيجابية HER2 يمكن ملاحظتها في مجموعة فرعية سرطانات الثدي ويولد المعضلات السريرية. وهنا، نقدم بروتوكول موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لتحديد وقياس ومقارنة HER2 الورم داخل التغاير الوراثي في سلسلة كبيرة من سرطان الثدي بين المجهزة.
Abstract
العلاجات الموجهة ضد مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) قد تغيرت تغيرا جذريا النتيجة للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي إيجابية HER2. ومع ذلك، يعرض أقلية حالات توزيعاً غير متجانسة من الخلايا إيجابية HER2، الذي يولد التحديات السريرية الكبرى. وحتى الآن، وقد اقترحت لا بروتوكولات موحدة وموثوقة للتوصيف والتحديد الكمي ل HER2 التضخيم الجيني غير متجانسة في أفواج كبيرة. وهنا، نقدم منهجية الفائق لتقييم حالة HER2 في وقت واحد عبر مختلف المناطق الطبوغرافية من سرطانات الثدي متعددة. على وجه الخصوص، نحن لتوضيح الإجراءات المختبرية لبناء الأنسجة معزز [ميكروارس] (طرفية) تتضمن تعيين مستهدفة من الأورام. لقد تم تحسين كافة معلمات الجمعية التونسية للأمهات على وجه التحديد للفضة في الموقع التهجين (سيش) الفورمالين–الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) أنسجة الثدي. يجب إجراء تحليل المناعي المؤشرات الحيوية التنبؤية وتنبؤاتها (أي، ER، العلاقات العامة، Ki67 و HER2) باستخدام إجراءات التشغيل الآلي. تم تنفيذ بروتوكول سايش مخصصة للسماح بتحليل الجزيئات عالية الجودة عبر الأنسجة المتعددة التي خضعت لإجراءات التثبيت وتجهيز وتخزين مختلفة. في هذه الدراسة، ونحن نقدم دليلاً لمبدأ أن تسلسل الحمض النووي معين يمكن أن يكون سرطان الثدي بين المجهزة ومترجمة في نفس الوقت في مناطق طبوغرافية متميزة متعددة باستخدام وسيلة كفؤة وفعالة من حيث التكلفة.
Introduction
HER2 هو بروتوونكوجيني أوفيريكسبريسيد وتضخيمه في 15-30 ٪ من سرطانات الثدي الغازية كل1،2. HER2 overexpression يتم الاستدلال بالوجود > الخلايا 10% بغشاء قوي المناعي (المدينة) تلوين (3 +)، بينما يمكن تقييم التضخيم الجيني عند نسبة HER2/السنترومير لا إيه تو أو عدد نسخ الجينات هو إيه سيكس، في فرز الأصوات في خلايا أقل 20 في الموقع التهجين (العش)3.
التغاير الوراثي داخل ورم وصفت على نطاق واسع في سرطان الثدي، كونه من مساهمين ضارة المحتملة لتقييم المؤشرات الحيوية وعلاجات الاستجابة4. وفقا لكلية الأطباء الأمريكية (CAP) تغاير HER2 موجود إذا كان يتم تضخيمه HER2 في > 5% و < % 50 من التسلل إلى ورم الخلايا5. ومن المؤسف أن الإصابة الفعلية بالتغاير HER2 المكانية في سرطان الثدي يبقى موضع جدل بين علماء ومع بعض المؤلفين الحفاظ على أن حدث نادر جداً والبعض الآخر مما يوحي بأن تصل إلى 40% من الحالات HER2 متغايرة1،5،،من67،،من89،10. وعلى الرغم من الآليات البيولوجية التي يرتكز عليها هذا الشرط لا بعد بالكامل تتضح، آثار الورم داخل HER2 التغايرية السريرية وتنبؤاتها حاسمة بالنسبة ل مرضى سرطان الثدي11.
في الآونة الأخيرة، ظهرت التقنيات الجزيئية مشرق الحقل، مثل ايش اللونية (CISH) والعش الفضي (سيش)، كوسائل موثوق بها للكشف عن تغاير HER2 في الأنسجة FFPE، مع بعض المزايا مقارنة الفلورية العش (الأسماك)12. وللأسف، لا يزال تحليل الجزء الأكبر من حالات فردية غير عملي في دراسات بحثية كبيرة الأتراب. وقد اقترح العديد من المجموعات أن مزيج هيستوتشيميستري، المدينة، والعش مع التكنولوجيات الجمعية التونسية للأمهات يمكن أن تمثل استراتيجية قيمة في دراسة سرطان علم الأحياء13،14،،من1516. مع هذا الأسلوب معتمداً على نطاق واسع، وعينات الأنسجة من مختلف المرضى يمكن تحليلها في الوقت ذاته، تقليل الأنسجة والكواشف المستخدمة، ومما يعزز تحليل موحد لمجموعة كبيرة من الحالات14. ومع ذلك، لا يوجد أية بروتوكولات متاحة متزامنة الفائق الجزيئية توصيف عينات الأنسجة المتعددة التي خضعت للتجهيز من حيث الكواشف وأوقات التثبيت، وأساليب الحفظ العاملون بهذه المحفوظات كما مختلفة كتل.
النظر إلى الآثار السريرية وتنبؤاتها للتباين المكاني HER2 في سرطان الثدي، قمنا بتطوير منصة جزيئية متكاملة لتقييم ذلك في سلسلة كبيرة من الحالات تقوم المجهزة. هنا، نحن تصور استراتيجيات معمل لتوليد وتحليل التباين داخل ورم التضخيم HER2 في طرفية عالية الغلة من سرطان الثدي عن طريق سايش. تم وضع بروتوكول التالية للأورام قياس > 5 ملم (> pT1b وفقا لعام 2017 تنم)17. لآفات أصغر، نوصي بإجراء التحليل على مقاطع المسلسل قلق. لدينا إجراء يسمح لتحليل المدينة وسيش المتزامن لسرطان الثدي يصل إلى 30، يشمل متوسط 6 مجالات متميزة (مجموعة 4-8) لكل حالة على حدة. بالإجمال، سيتم إنشاء 180 النوى الأنسجة من 1 مم في القطر، مع 500 ميكرومتر بين النوى، ومم 2 بين الشبكة والحواف لكل كتلة الجمعية التونسية للأمهات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تفصيلية استراتيجيات مختبر لإجراء تحليلات سايش الجين HER2 والسنترومير المقابلة لها في طرفية عالية الغلة من سرطان الثدي بين المجهزة. هذا الأسلوب هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن تنفذ في معظم المختبرات لدراسة التغاير التضخيم الجين HER2 في أفواج كبيرة من الثدي السرطان استردا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لا شيء.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
References
- Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
- Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
- Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
- Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
- Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
- Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
- Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
- Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. ‘Genetic heterogeneity’ in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
- Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
- Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
- Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
- Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
- Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
- Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies – a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
- Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
- Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
- Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
- Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
- Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
- Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
- Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
- Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
- De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).
