Este protocolo descreve uma técnica usada para modelar a infecção de vírus Zika do cérebro humano em desenvolvimento. Usando sua ou linhas de células-tronco projetado, pesquisadores podem usar essa técnica para descobrir os vários mecanismos ou tratamentos que podem afetar o início infecção cerebral e microcefalia resultante em embriões de Zika infectado por vírus.
O recente surgimento de vírus Zika (ZIKV) em populações suscetíveis tem levado a um aumento abrupto na microcefalia e outras condições de desenvolvimento neurológico em recém-nascidos. Enquanto os mosquitos são a principal via de transmissão viral, também verificou a espalhar através do contato sexual e transmissão vertical de mãe-para-feto. Neste último caso de transmissão, devido ao tropismo viral exclusivo de ZIKV, o vírus é acredita-se que alvo predominantemente as células progenitoras neurais (NPCs) do cérebro em desenvolvimento.
Aqui um método para modelagem de infecção ZIKV e a resultante microcefalia, que ocorrem quando organoids cerebrais humanos são expostos viver ZIKV é descrito. Os organoids exibir altos níveis de vírus dentro de sua população de progenitoras neurais e morte celular grave e microcefalia para exposições ao longo do tempo. Este modelo de organoides cerebral tridimensional permite que os pesquisadores realizar experimentos de espécie de correspondência para observar e potencialmente intervir com infecção ZIKV do cérebro humano em desenvolvimento. O modelo fornece maior relevância sobre métodos padrão bidimensionais e contém a arquitetura celular humanos específicos e expressão de proteínas que não são possíveis em modelos animais.
Vírus Zika (ZIKV) espalhou-se rapidamente na Micronésia, Polinésia francesa e nas Américas e recentemente tem sido mostrado para atravessar a barreira placentária1,2 para infectar o cérebro fetal em desenvolvimento, levando a doenças neurológico tais como microcefalia3,4,5,6 . O impacto a longo prazo na vida destes pacientes e a actual falta de tratamento, tem levado pesquisadores e clínicos a embaralhar para uma melhor compreensão dos mecanismos por trás ZIKV infecção e replicação. Estudos anteriores têm examinado a infecção ZIKV em vitro sistemas em uma variedade de tipos de célula fisiologicamente relevantes a7,8,9, bem como na vivo10 com camundongos imunocompetentes e imunodeprimidos11,12,13 e primatas não-humanos14,15,16. Além destas técnicas mais convencionais, vários grupos têm implementado células-tronco derivadas de organoids cerebral para entender mais sobre infecção ZIKV do cérebro humano em desenvolvimento. Estes grupos têm utilizado a organoids cerebral humano para confirmar o fenótipo de microcefalia17,18, receptores ligados à entrada de vírus19de investigar, examinar as respostas fisiológicas a infecção20 , 21e potencialmente tela para droga candidatos22. Aqui é descrita uma técnica para rapidamente produzindo e infectar células-tronco derivadas de organoids cerebral, conforme mostrado anteriormente,19, para melhorar o entendimento da infecção ZIKV do cérebro humano em desenvolvimento.
Desde que o organoids são formados a partir de culturas de células-tronco (PSC) padrão pluripotentes, esta técnica permite uma variedade de questões científicas a serem respondidas em relação a infecção viral do cérebro em desenvolvimento. Por exemplo, engenharia CRISPR pode ser usada para modificar estas linhas PSC antes da infecção de organoides em um ritmo mais rápido do que a maioria na vivo genética estuda19. Além disso, ao contrário no padrão duas culturas dimensional (2D) diferenciação, organoids expor a arquitetura celular complexa que é essencial para o corticogenesis, e estudos recentes têm mostrado que esta arquitetura pode ser interrompida após infecção 21. Finalmente, o custo relativamente baixo de gerar organoids permite maior experimentação de taxa de transferência e triagem quando comparado aos modelos na vivo . Por outro lado, existem algumas desvantagens para a utilização de organoids para estudar ZIKV. Enquanto organoids são biologicamente muito mais relevante do que culturas 2D, existem desafios adicionais na avaliação do organoids devido à sua natureza (3D) tridimensional. Imagem latente e dissociação de organoids tende a envolver mais equipamentos e um maior investimento de recursos do que em culturas 2D padrão. Além disso, organoids falta a vasculatura e componentes imunológicos que estão presentes em modelos na vivo , para que pesquisadores interessados aqueles aspectos da infecção viral são aconselhados a procurar um protocolo alternativo.
Há um número de técnicas para a formação de organoids humana e neurospheres na cultura, e normalmente caem dentro das categorias unpatterned ou estampados . Modelado métodos implementam fatores para regular a Wnt, BMP, TGFβ e outras vias de sinalização para empurrar a diferenciação na direção de linhagens específicas23. Unpatterned métodos, como o descrito aqui, aproveite a propensão para as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e células estaminais embrionárias humanas (hESCs) para diferenciar-se em direção a uma linhagem neuroectodérmico por padrão24. Após cerca de três semanas de diferenciação, as resultantes organoids consistem em grande, biomimetic neuroepithelial estruturas que contêm vários tipos de células que são observados no cérebro em desenvolvimento precoce.
A técnica para produzir organoids de culturas PSC padrão, livre de alimentador e infectando esses organoids com ZIKV é apresentada na íntegra. Para orientação sobre os métodos de cultivo necessários para EPS alimentador-livre, por favor consulte métodos anteriores Publicações25,26. Além disso, para aplicar quantidades consistentes de vírus para múltiplas experiências, é importante calcular o MOI antes do tempo. Isto é feito através da realização de uma infecção de células Vero, seguido de um tratamento com meio de sobreposição, incubação e imunocoloração. Descrições e métodos dessa técnica têm sido descritas anteriormente19,,27.
Uma vez que a cultura do PSC alcança a confluência da meta de 50% – 70%, as células são então dissociadas e agregadas em placas de 96 poços de fixação ultra baixo. As células são mantidas durante 3 dias nos meios de manutenção de células-tronco xeno-livre (SCMM) e então convertidas em uma mídia de indução neural para o restante da cultura. Uma vez que o organoids ter diferenciado para 3 semanas, a infecção pode ser realizada. Rotineiramente tirando fotos durante a semana seguinte, infecção, os pesquisadores observarão morte celular progressiva e o rompimento de organoides. Pesquisadores também podem dissociar a organoids este tempo para conduzir transcricional ou proteomic perfilação no. Cryosectioning e lightsheet métodos são recomendados para a imagem latente, e os pesquisadores podem esperar ver altos níveis de infecção e replicação viral particularmente dentro das populações de célula (NPC) progenitoras neurais no organoids. Em última análise, esta técnica permite que pesquisadores examinar rapidamente os mecanismos de infecção viral do cérebro humano com equipamento de baixo custo e limitado.
Existem várias advertências para considerar quando utilizando organoids cerebral humano para investigar infecção ZIKV. Uma consideração importante é a formação de organoides e estrutura é altamente dependente da linha de células-tronco do qual são formados. Tome cuidado ao comparar entre linhas celulares, incluindo linhas isogénicas de engenharia; é melhor fazer conclusões usando vários subclones e idealmente, várias linhas de células-tronco. Além disso devido a esta diferença de linhas celulares, recomenda-se experiências piloto para garantir que a diferenciação adequada está ocorrendo no organoids. Enquanto as estruturas neuroepithelial são visíveis pela microscopia brightfield, também é aconselhável para realizar experimentos qRT-PCR ou cryosectioning para procurar marcadores de diferenciação neural como PAX6 ou fosfo-vimentina.
Um deve também antecipar considerável variabilidade entre organoids dentro da mesma linha de celular. Devido à natureza unpatterned do protocolo, o número e tamanho das estruturas neuroepithelial podem variar entre organoids individuais. Normalmente, pode-se esperar pelo menos dois grandes (> 200 µm de diâmetro por D24) rosetas neurais por organoides. Por esta razão, estudos longitudinais, como a observação da mudança no tamanho de organoides ao ser infectado, são particularmente esclarecedoras. Variabilidade entre lotes também pode ocorrer, com a causa mais provável para isso ser imprecisa célula contando ou semeadura. É recomendável realizar várias acusações e ter certeza de que a suspensão celular é bem misturada antes da semeadura nas chapas de fundo-ULA U 96 poços.
Quando o cultivo organoids em placas de fundo-ULA U 96 poços, planeja ver efeitos de evaporação considerável em torno das bordas das placas. O ideal é preencher esses poços com PBS e trabalhar apenas com os poços de 60 centro. Devido a evaporação, organoids em poços do exteriores será exposto a condições diferentes do que aqueles no centro, o que provavelmente vai afetar seu crescimento e diferenciação. Por favor, considere isso ao planejar o número de organoids que serão necessários para as experiências. Além disso, o organoids vai começar a overgrow o formato de 96 poços após cerca de 30 dias, que será visíveis devido a descoloração do meio de cultura. Se planejando tomar o organoids passado os 30 dias, é aconselhável transferir o organoids para uma placa de 24 ULA. Para realizar a transferência, use tesouras para cortar uma ponta P1000 para que a abertura é muito maior do que o organoids se e transferir o organoids por pipetagem.
Organoids cerebrais humanos mantenha grande potencial em fazer avançar a compreensão do campo de neurodesenvolvimento e doença. Os pesquisadores são encorajados a modificar o protocolo conforme necessário. Por exemplo, um pode implementar fatores de padronização para melhorar a eficiência de diferenciação para tipos específicos de célula, permitindo-lhes explorar os impactos virais em determinadas regiões anatômicas. Os efeitos do desenvolvimento neurológico do ZIKV são ainda mal compreendidos, mas esta nova abordagem dará pesquisadores de uma forma acessível, rápida e alta produtividade de investigar os mecanismos de infecção.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecer ajuda com propagação inicial e quantificação de ZIKV Priscilla L. Yang e Dominique J. Burri da faculdade de medicina de Harvard. Gostaríamos também de agradecer Nathaniel D. Kirkpatrick apoio de imagem. K.E. foi apoiado pelo centro de Stanley para pesquisa psiquiátrica e o Instituto de células-tronco de Harvard.
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |