Questo protocollo descrive una tecnica usata per modellare l’infezione del virus di Zika di sviluppo del cervello umano. Utilizzando wildtype o linee di cellule staminali ingegnerizzati, i ricercatori possono utilizzare questa tecnica per scoprire i vari meccanismi o trattamenti che possono influenzare l’infezione iniziale del cervello e conseguente microcefalia in embrioni di Zika infettati da virus.
Il recente emergere di Zika virus (ZIKV) in popolazioni suscettibili ha portato ad un aumento brusco della microcefalia e altre condizioni di neurodevelopmental nei neonati. Mentre le zanzare sono la principale via di trasmissione virale, ha anche dimostrato a diffondere attraverso il contatto sessuale e trasmissione verticale madre-di-feto. In quest’ultimo caso della trasmissione, a causa del tropismo virale unico di ZIKV, il virus si crede principalmente bersaglio le cellule progenitrici neurali (NPC) di sviluppo del cervello.
Qui un metodo per la modellazione di infezione ZIKV e la conseguente microcefalia, che si verificano quando organoids cerebrale umana sono esposti per vivere ZIKV è descritto. Il organoids visualizzare livelli elevati del virus all’interno della loro popolazione di cellule progenitrici neurali e severa delle cellule morte e microcefalia per mostre nel corso del tempo. Questo modello tridimensionale organoid cerebrale permette ai ricercatori di condurre esperimenti di specie-abbinati per osservare e potenzialmente intervenire con l’infezione di ZIKV di sviluppo del cervello umano. Il modello fornisce maggiore rilevanza rispetto ai metodi standard bidimensionali e contiene umani specifici architettura cellulare e l’espressione della proteina che non sono possibili nei modelli animali.
Zika virus (ZIKV) has rapidly spread in Micronesia, French Polynesia, and the Americas, and has recently been shown to cross the placental barrier1,2 to infect the developing fetal brain, leading to neurodevelopmental diseases such as microcephaly3,4,5,6 . The long-term impact on these patients' lives, and the current lack of treatment, has led researchers and clinicians to scramble for a better understanding of the mechanisms behind ZIKV infection and replication. Previous studies have examined ZIKV infection of in vitro systems in a variety of physiologically-relevant cell types7,8,9, as well as in vivo10 with immunocompetent and immunocompromised mice11,12,13 and non-human primates14,15,16. In addition to these more conventional techniques, several groups have implemented stem cell-derived cerebral organoids to understand more about ZIKV infection of the developing human brain. These groups have utilized human cerebral organoids to confirm the microcephaly phenotype17,18, investigate receptors linked to virus entry19, examine physiological responses to infection20,21, and potentially screen for drug candidates22. Here a technique for rapidly producing and infecting stem-cell derived cerebral organoids is described, as shown previously19, to improve the understanding of ZIKV infection of the developing human brain.
Since the organoids are formed from standard pluripotent stem cell (PSC) cultures, this technique allows for a variety of scientific questions to be answered regarding viral infection of the developing brain. For example, CRISPR engineering may be used to modify these PSC lines prior to organoid infection at a faster rate than most in vivo genetic studies19. Additionally, unlike in standard two dimensional (2D) differentiation cultures, organoids exhibit the complex cellular architecture that is critical for corticogenesis, and recent studies have shown that this architecture may be disrupted upon infection21.Finally, the relatively low cost of generating organoids allows for higher throughput experimentation and screening when compared to in vivo models. On the other hand, there are some disadvantages to the utilization of organoids to study ZIKV. While organoids are far more biologically relevant than 2D cultures, there are additional challenges in the assessment of organoids due to their three-dimensional (3D) nature. Imaging and dissociation of organoids tends to involve more equipment and a larger investment of resources than in standard 2D cultures. Additionally, organoids lack the vasculature and immunological components that are present in in vivo models, so researchers interested in those aspects of viral infection are advised to seek an alternative protocol.
There are a number of techniques for the formation of human organoids and neurospheres in culture, and they typically fall within the patterned or unpatterned categories. Patterned methods implement factors to regulate Wnt, BMP, TGFβ, and other signaling pathways to push differentiation toward specific lineages23. Unpatterned methods, such as the one described here, take advantage of the propensity for induced pluripotent stem cells (iPSCs) and human embryonic stem cells (hESCs) to differentiate toward a neuroectodermal lineage by default24. After approximately three weeks of differentiation, the resulting organoids consist of large, biomimetic neuroepithelial structures that contain several cell types that are observed in the early developing brain.
The technique for producing organoids from standard, feeder-free PSC cultures, and infecting these organoids with ZIKV is presented in full. For guidance on the culturing methods needed for feeder-free PSCs, please refer to previous methods publications25,26. Additionally, in order to apply consistent amounts of virus for multiple experiments, it is important to calculate the MOI ahead of time. This is done by conducting an infection of Vero cells, followed by treatment with overlay medium, incubation, and immunostaining. Descriptions and methods of this technique have been previously described19,27.
Once the PSC culture reaches the target confluence of 50%-70%, the cells are then dissociated and aggregated into ultra-low attachment 96-well plates. The cells are maintained for 3 days in xeno-free stem cell maintenance media (SCMM), and then converted to a neural induction media for the remainder of the culture. Once the organoids have differentiated for 3 weeks, the infection can be conducted. By routinely taking images during the week following infection, researchers will observe progressive cell death and disruption of the organoid. Researchers may also dissociate the organoids at this time to conduct transcriptional or proteomic profiling. Cryosectioning and lightsheet methods are recommended for imaging, and researchers can expect to see high levels of infection and viral replication particularly within the neural progenitor cell (NPC) populations in the organoids. Ultimately, this technique allows researchers to rapidly examine the mechanisms of viral infection of the human brain with low cost and limited equipment.
Esistono diversi aspetti da considerare quando si utilizza organoids cerebrale umana per indagare l’infezione ZIKV. Un’importante considerazione è che la formazione organoid e struttura dipende fortemente dalla linea di cellule staminali da cui sono formate. Prendersi cura quando si confrontano tra linee cellulari, compreso isogenic lines ingegnerizzati; si consiglia di fare conclusioni utilizzando più subcloni e idealmente più linee di cellule staminali. Inoltre a causa di questa differenza nelle linee cellulari, esperimenti pilota per garantire che corretta differenziazione è in corso nella organoids è consigliabile. Mentre le strutture di neuroepithelial sono visibili mediante microscopia in campo chiaro, inoltre è suggerito per condurre esperimenti qRT-PCR o cryosectioning per cercare gli indicatori di differenziazione neurale come PAX6 o fosfo-vimentin.
Si dovrebbe anche prevedere considerevole variabilità tra organoids all’interno della stessa linea cellulare. A causa della natura non nanostrutturata del protocollo, il numero e le dimensioni delle strutture neuroepiteliali può variare tra organoids individuali. In genere, ci si può aspettare almeno due grandi (> 200 µm di diametro da D24) neurale rosette a organoid. Per questo motivo, gli studi longitudinali, come l’osservazione del cambiamento nella dimensione organoid dopo l’infezione, sono particolarmente illuminanti. Variabilità tra lotti potrebbero verificarsi, con la causa più probabile per questo essendo conta cellulare imprecise o semina. È consigliabile condurre più conteggi e per assicurarsi che la sospensione cellulare è ben miscelata prima della semina sulle piastre di fondo ULA U 96 pozzetti.
Quando la coltura organoids in fondo ULA U 96 pozzetti, intenzione vedendo evaporazione considerevoli effetti intorno ai bordi delle piastre. È ideale per riempire questi pozzetti con PBS e funzionano solo con il centro 60 wells. Dovuto all’evaporazione, organoids nei pozzetti esterni saranno esposti a condizioni diverse rispetto a quelle del centro, che probabilmente interesserà la loro crescita e la differenziazione. Si prega di considerare questo quando si pianifica il numero di organoids che saranno necessarie per gli esperimenti. Inoltre, organoids inizierà a soppiantare il formato 96 pozzetti dopo circa 30 giorni, che sarà visibile a causa lo sbiadimento del terreno di coltura. Se l’intenzione di prendere il organoids negli ultimi 30 giorni, si consiglia di trasferire la organoids per una piastra a 24 pozzetti ULA. Per effettuare il trasferimento, usare le forbici per tagliare un suggerimento P1000, in modo che l’apertura è molto più grande il organoids se stessi e trasferire la organoids pipettando.
Organoids cerebrale umana tenere grandi potenzialità nel promuovere la comprensione del campo del neurosviluppo e malattia. I ricercatori sono incoraggiati a modificare il protocollo come necessario. Ad esempio, uno potrebbe implementare fattori di campitura per migliorare l’efficienza di differenziazione verso tipi cellulari specifici, permettendo loro di esplorare l’impatto virale su alcune regioni anatomiche. Gli effetti sullo sviluppo neurologico del ZIKV sono ancora poco conosciuti, ma questo nuovo approccio darà ai ricercatori un modo accessibile, rapido e ad alta produttività di indagare i meccanismi dell’infezione.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Priscilla L. Yang e Dominique J. Burri della Harvard Medical School per aiuto con propagazione iniziale e la quantificazione dei ZIKV. Vorremmo anche ringraziare Nathaniel D. Kirkpatrick per il supporto dell’imaging. K.E. è stato sostenuto dal centro di Stanley per la ricerca psichiatrica e l’Harvard Stem Cell Institute.
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |