نمذجة عدوى فيروس زكى من وضع الدماغ البشري في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أورجانويدس الدماغي
Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنية تستخدم لنموذج زكى الإصابة بعدوى الفيروس من الدماغ البشري. استخدام wildtype أو خطوط الخلايا الجذعية هندسيا، قد الباحثين استخدام هذه التقنية للكشف عن مختلف الآليات أو العلاجات التي قد تؤثر على الإصابة المبكرة بالدماغ وصغر الرأس الناتجة في الأجنة المصابة بالفيروس زكى.
Abstract
ظهور فيروس Zika (زيكف) في السكان عرضه مؤخرا أدى إلى حدوث زيادة مفاجئة في صغر الرأس والشروط النمائية الأخرى في الأطفال حديثي الولادة. بينما البعوض هي الطريق الرئيسي لانتقال العدوى الفيروسية، كما ثبت أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي والانتقال الرأسي من الأم إلى الجنين. في هذه الحالة الأخيرة لانتقال العدوى، بسبب انتحاء الفيروسية فريدة من نوعها من زيكف، يعتقد أن الهدف الغالب الفيروس الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) من الدماغ.
هنا طريقة لنمذجة الإصابة زيكف، وصغر الرأس الناتجة عن ذلك، التي تحدث عند أورجانويدس الدماغية البشرية تتعرض للعيش زيكف وهو وصف. أورجانويدس عرض مستويات عالية من الفيروس ضمن سكانها السلف العصبية، ويحمل موت الخلايا الشديدة وصغر الرأس مع مرور الوقت. يسمح هذا النموذج ثلاثي الأبعاد أورجانويد الدماغي الباحثين لإجراء تجارب الأنواع المطابقة لمراقبة ويحتمل أن تتدخل مع الإصابة زيكف من الدماغ البشري. النموذج يوفر تحسين مدى صلة أكثر الأساليب القياسية ثنائية الأبعاد، ويحتوي على بنية الخلوية الخاصة بالإنسان والتعبير البروتين التي غير ممكنة في نماذج حيوانية.
Introduction
فيروس زكى (زيكف) قد انتشر بسرعة في ميكرونيزيا، بولينيزيا الفرنسية، والأمريكتين، وأظهرت مؤخرا لعبور حاجز المشيمة1،2 لتصيب المخ الجنين النامي، مما يؤدي إلى الأمراض العصبية النمائية مثل هذه صغر الرأس3،4،،من56 . وقد أدى تأثير طويل الأجل على حياة هؤلاء المرضى، والنقص الحالي في العلاج، والباحثين والأطباء للتدافع لتحقيق فهم أفضل للآليات وراء الإصابة زيكف والنسخ المتماثل. الدراسات السابقة وقد فحص الإصابة زيكف في المختبر نظم في مجموعة متنوعة من الخلية ذات الصلة بالناحية الفسيولوجية أنواع7،،من89، فضلا عن في فيفو10 مع الفئران الأشخاص والمناعة11،،من1213 والمقدمات غير البشرية14،،من1516. وبالإضافة إلى هذه التقنيات التقليدية أكثر، نفذت عدة مجموعات أورجانويدس الدماغي المشتقة من الخلايا الجذعية لفهم المزيد عن الإصابة زيكف من الدماغ البشري. واستخدمت هذه الجماعات البشرية أورجانويدس الدماغي تأكيد17،النمط الظاهري صعل18، التحقيق في مستقبلات مرتبطة بالفيروس دخول19، دراسة الاستجابات الفسيولوجية للإصابة20 , 21، ويحتمل أن تكون الشاشة للمخدرات المرشحين22. هنا هو وصف تقنية لإنتاج وإصابة الخلايا الجذعية المشتقة دماغي أورجانويدس بسرعة، كما هو موضح سابقا،19إلى تحسين الفهم للإصابة زيكف من الدماغ البشري.
منذ أورجانويدس تتشكل من ثقافات القياسية pluripotent الخلايا الجذعية (PSC)، يسمح هذا الأسلوب لمجموعة متنوعة من المسائل العلمية الرد عليها فيما يتعلق بالتهاب فيروسي في الدماغ النامي. على سبيل المثال، قد تستخدم الهندسة كريسبر لتعديل هذه الأسطر PSC قبل الإصابة أورجانويد بوتيرة أسرع من معظم في فيفو الوراثية الدراسات19. بالإضافة إلى ذلك، خلافا لمعرض أورجانويدس في معيار ثقافتين تمايز الأبعاد (2D)، البنية الخلوية المعقدة التي حاسمة بالنسبة كورتيكوجينيسيس، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن هذا الهيكل قد تتعطل عند الإصابة 21. وأخيراً، أن التكلفة المنخفضة نسبيا لتوليد أورجانويدس يسمح بأعلى إنتاجية التجريب والفحص عند مقارنتها بنماذج في فيفو . من ناحية أخرى، هناك بعض العيوب للاستفادة أورجانويدس لدراسة زيكف. بينما أورجانويدس أكثر بكثير من الناحية البيولوجية ذات الصلة من الثقافات 2D، هناك تحديات إضافية في تقييم أورجانويدس نظراً لطبيعتها (3D) ثلاثي الأبعاد. التصوير وتفكك أورجانويدس يميل إلى إشراك المزيد من المعدات واستثمارا أكبر من الموارد من الثقافات 2D القياسية. بالإضافة إلى ذلك، تفتقر أورجانويدس المفرج والمكونات المناعية التي موجودة في النماذج في فيفو ، حيث ينصح الباحثين المهتمين بهذه الجوانب من العدوى الفيروسية التماس بروتوكولا بديلة.
وهناك عدد من التقنيات لتشكيل أورجانويدس البشرية ونيوروسفيريس في الثقافة، وأنها تقع عادة ضمن فئات منقوشة أو أونباتيرنيد . تنفيذ أساليب منقوشة عوامل لتنظيم Wnt، BMP، TGFβ، ومسارات الإشارات الأخرى لدفع التمايز تجاه الأنساب محددة23. أساليب أونباتيرنيد، مثل تلك الموضحة هنا، الاستفادة من الميل للخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) والخلايا الجذعية البشرية الجنينية (هيسكس) التفريق بين اتجاه نسب نيوروكتوديرمال بالافتراضي24. بعد حوالي ثلاثة أسابيع تمايز، تتكون أورجانويدس الناتجة من الهياكل نيوروبيثيليال المحاكاة البيولوجية الكبيرة، التي تحتوي على العديد من أنواع الخلايا التي لوحظت في الدماغ المبكر.
تقنية لإنتاج أورجانويدس من الثقافات PSC القياسية، وخالية من علبة التغذية بالورق، وتصيب هذه أورجانويدس مع زيكف يرد بالكامل. للتوجيهات بشأن أساليب تثقيف الحاجة PSCs خالية من علبة التغذية بالورق، يرجى الرجوع إلى المنشورات الأساليب السابقة25،26. بالإضافة إلى ذلك، من أجل تطبيق مبالغ متسقة للفيروس لتجارب متعددة، من المهم لحساب وزارة الداخلية قبل الموعد المحدد. ويتم ذلك عن طريق إجراء وي خلايا فيرو، متبوعاً بالعلاج مع تراكب المتوسطة، والحضانة، وإيمونوستينينج. الوصف وأساليب هذا الأسلوب تم وصفه سابقا19،27.
حالما تصل ثقافة PSC إلى التقاء الهدف من 50 ٪-70 ٪، الخلايا ثم فصلها وتجميعها في لوحات 96-كذلك مرفق منخفضة للغاية. الخلايا لمدة 3 أيام في الخلايا الجذعية خالية من كرة صيانة وسائل الإعلام (اللجنة)، وثم تم تحويلها إلى وسائط التعريفي العصبية لما تبقى الثقافة. متى كانت متباينة أورجانويدس لمدة 3 أسابيع، يمكن أن تجري العدوى. بأخذ الصور بشكل روتيني خلال الأسبوع التالي للإصابة، سيراقب الباحثون موت الخلية التدريجي، واضطراب أورجانويد. قد ينأى الباحثون أيضا أورجانويدس في هذا الوقت إجراء النسخي أو التنميط البروتين. ينصح بأساليب كريوسيكتيونينج ولايتشيت للتصوير، والباحثين يمكن أن نتوقع أن نرى مستويات عالية من العدوى والنسخ المتماثل الفيروسية خاصة ضمن سكان الخلية (مجلس الشعب) السلف العصبية أورجانويدس. وفي نهاية المطاف، هذا الأسلوب يسمح الباحثون لدراسة آليات العدوى الفيروسية للدماغ البشري مع معدات منخفضة التكلفة ومحدودية سرعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك العديد من المحاذير أخذها في الاعتبار عند استخدام أورجانويدس المخ البشري للتحقيق في الإصابة زيكف. أحد الاعتبارات المهمة هو أن تشكيل أورجانويد وهيكل يعتمد اعتماداً كبيرا على خط الخلايا الجذعية التي تتشكل منها. العناية عند مقارنة بين خطوط الخلايا، بما في ذلك خطوط هندستها اسوي؛ فمن الأفضل لجعل استنتاجات استخدام سوبكلونيس متعددة، ومن الناحية المثالية من خطوط الخلايا الجذعية متعددة. بالإضافة إلى ذلك بسبب هذا الاختلاف في خطوط الخلايا، يوصي بتجارب رائدة لضمان حدوث تمايز السليم في أورجانويدس. في حين تظهر بالفحص المجهري برايتفيلد الهياكل نيوروبيثيليال، يقترح أيضا إجراء تجارب بكر قرة أو كريوسيكتيونينج للبحث عن علامات التمايز العصبية مثل PAX6 أو فيمنتين والرمات.
وينبغي أن المرء أيضا تباين كبير بين أورجانويدس داخل نفس خط الخلية. نظراً لطبيعة البروتوكول أونباتيرنيد، يمكن أن تختلف عدد وحجم هياكل نيوروبيثيليال بين أورجانويدس الفردية. عادة، يمكن أن نتوقع على الأقل اثنان كبير (> 200 ميكرومتر في القطر ب D24) مأخذ العصبية الواحدة أورجانويد. لهذا السبب، الدراسات الطولية، مثل مراقبة التغيير في حجم أورجانويد عند الإصابة، لا سيما المنير. التباين بين دفعات قد يحدث أيضا، مع السبب الأرجح لذلك يجري عد الخلايا غير دقيقة أو البذر. من المستحسن القيام بتهم متعددة والتأكد من تعليق خلية يختلط جيدا قبل البذر على لوحات 96 ش العلا-أسفل البئر.
عند استزراع أورجانويدس في لوحات 96 ش العلا-أسفل البئر، خطة بشأن رؤية آثار التبخر كبيرة حول حواف الصفائح. ومثالي لملء هذه الآبار مع برنامج تلفزيوني وتعمل فقط مع الآبار 60 مركز. بسبب التبخر، أورجانويدس في الآبار الخارجي سوف يتعرض لظروف مختلفة عن تلك الموجودة في المركز، والتي يرجح أن تؤثر على النمو والتمايز. يرجى النظر في هذا عند التخطيط لعدد أورجانويدس التي ستكون هناك حاجة لإجراء تجارب عليها. بالإضافة إلى ذلك، سوف يبدأ أورجانويدس كسا شكل 96-جيدا بعد 30 يوما تقريبا، التي ستكون مرئية بسبب تلون الثقافة المتوسطة. إذا تخطط لأخذ أورجانويدس في الماضي 30 يوما، فمن المستحسن نقل أورجانويدس إلى لوحة العلا 24-جيدا. إجراء النقل واستخدام مقص لقص تلميح P1000 حيث يكون الافتتاح أكبر بكثير من أورجانويدس أنفسهم، ونقل أورجانويدس واسطة بيبيتينج.
أورجانويدس المخ البشري إمكانات كبيرة في تعزيز الفهم للحقل للنماء العصبي والأمراض. الباحثون مدعوون إلى تعديل البروتوكول على النحو اللازم. على سبيل المثال، يمكن تنفيذ أحد العوامل الزخرفة لتحسين كفاءة التمايز تجاه أنواع خلية معينة، والسماح لهم لاستكشاف آثار الفيروسية في بعض المناطق التشريحية. آثار عصبية زيكف هي لا تزال غير مفهومة، ولكن هذا النهج الجديد سوف تعطي الباحثين بطريقة ميسرة وسريعة، والفائق التحقيق آليات العدوى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون بريسيلا لام يانغ وبوري جيه دومينيك من مدرسة هارفارد الطبية للمساعدة في النشر الأولى والتحديد الكمي زيكف. كما نود أن نشكر ناثانيل دال كيركباتريك لدعم التصوير. وأيد المركز ستانلي K.E. للبحوث النفسية ومعهد الخلايا الجذعية في جامعة هارفارد.
Materials
| Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
| Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
References
- Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
- Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
- Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
- Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
- Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
- Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
- Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204 (2016).
- Li, X. -. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
- Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
- Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
- Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
- Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).
