JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Kök hücre kullanarak gelişmekte olan insan beyni Vitro Zika virüs enfeksiyonu modelleme serebral Organoids türetilmiş

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56404
, , ,
1Department of Neuroscience,Novartis Institutes for BioMedical Research, 2Stanley Center for Psychiatric Research,Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology and Harvard Stem Cell Institute,Harvard University

Summary

Bu iletişim kuralı Zika virüs enfeksiyonu gelişmekte olan insan beyninin model oluşturmak için kullanılan bir teknik anlatılmaktadır. Wildtype veya mühendislik kök hücre hatları kullanarak, araştırmacılar, çeşitli mekanizmalar veya erken beyin enfeksiyon ve Zika virüs bulaşmış embriyo elde edilen microcephaly etkileyebilir tedavi ortaya çıkarmak için bu tekniği kullanabilir.

Abstract

Zika virüs (ZIKV) duyarlı nüfusu son ortaya çıkması microcephaly ani bir artış ve yeni doğan bebeklerde nörogelişimsel koşulları yol açmıştır. Sivrisinek viral iletim ana yol olmakla birlikte, aynı zamanda cinsel temas ve dikey anne fetus iletim yaymak için gösterilmiştir. Bu ikinci durumda iletim, ZIKV, benzersiz viral tropism nedeniyle virüs gelişmekte olan beyin nöral progenitör hücrelerinin (NPCs) ağırlıklı olarak hedefe inanılıyor.

İnsan beyin organoids maruz burada modelleme ZIKV enfeksiyon ve sonuç microcephaly için bir yöntemi, bu ZIKV yaşamak için açıklanan meydana gelir. Organoids virüs nöral progenitör nüfusları içinde yüksek düzeyde görüntülemek ve şiddetli hücre ölümü ve microcephaly zaman içinde sergilemek. Bu üç boyutlu beyin organoid modeli tür eşlemeli deney gözlemlemek ve potansiyel olarak gelişmekte olan insan beyninin ZIKV enfeksiyon ile müdahale araştırmacılar verir. Model üzerinde standart iki boyutlu yöntemleri geliştirilmiş alaka sağlar ve insan özgü hücresel mimarisi ve hayvan modellerinde mümkün olmayan protein ifade içerir.

Introduction

Zika virüs (ZIKV) Mikronezya, Fransız Polinezyası ve Amerika’nın hızla yayıldı ve son zamanlarda nörogelişimsel hastalıklara kadar önde gelen gelişmekte olan fetal beyin bulaştırmak için plasenta bariyerini1,2 geçmeye gösterilmiştir microcephaly3,4,5,6 . Bu hasta hayatını ve tedavi, geçerli eksikliği üzerinde uzun vadeli etkisi araştırmacılar ve klinisyenler daha iyi ZIKV enfeksiyon ve çoğaltma arkasında mekanizmaları anlamak için mücâdele yol açmıştır. Önceki çalışmalarda ZIKV enfeksiyon, vitro sistemlerinin fizyolojik ilgili hücre türleri7,8,9, hem de vivo içinde10 ile çeşitli inceledik immün ve immün fareler11,12,13 ve insan dışı primatlar14,15,16. Bu daha geleneksel teknikleri yanı sıra çeşitli gruplar ZIKV enfeksiyon gelişmekte olan insan beyninin daha iyi anlamak için kök hücre kaynaklı serebral organoids hayata geçirdik. Bu gruplar insan beyin organoids microcephaly fenotip17,18onaylamak, virüs giriş19‘ a bağlı reseptörleri araştırmak, enfeksiyon20 fizyolojik yanıtlarını incelemek için kullanılan , 21ve potansiyel olarak uyuşturucu adaylar22için ekran. Burada hızla üreten ve kök hücre elde edilen serebral organoids bulaşmasını tekniği,19ZIKV enfeksiyon gelişmekte olan insan beyninin anlayış geliştirmek için daha önce gösterildiği gibi kullanılmıştır.

Organoids standart pluripotent kök hücre (PSC) kültürleri oluşturulmuş bu teknik bilimsel sorular çeşitli için gelişmekte olan beyin viral enfeksiyon ile ilgili olarak yanıtlanmasını sağlar. Örneğin, CRISPR mühendislik bu PSC hatları19en vivo genetik çalışmalar daha hızlı bir hızda organoid enfeksiyonu önce değiştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, standart iki boyutlu (2D) farklılaşma kültürlerde farklı olarak corticogenesis için önemlidir karmaşık hücresel mimarisi organoids sergi ve bu mimari enfeksiyon kesilebilir son çalışmalar göstermiştir 21. Son olarak, nispeten düşük maliyetli organoids üreten yüksek üretilen iş deneme ve in vivo modellere kıyasla tarama için izin verir. Öte yandan, ZIKV çalışmaya organoids kullanımı bazı sakıncaları vardır. Organoids 2D kültürleri çok daha biyolojik ilgili olmakla birlikte, orada ek zorluklar nedeniyle üç boyutlu (3D) doğaları organoids değerlendirilmesi. Görüntüleme ve organoids ayrılma eğilimi daha fazla ekipman ve standart 2D kültürlerde daha kaynak daha büyük bir yatırım dahil etmek. Ayrıca, organoids damarlara ve araştırmacılar bu yönlerini viral enfeksiyon baktılar bir alternatif iletişim kuralı aramak için tavsiye edilir böylece in vivo modellerinde mevcut immünolojik bileşenleri yoksundur.

Orada bir takım teknikler insan organoids ve kültür neurospheres oluşumu için ve genellikle içinde desenli veya unpatterned kategorilere ayrılır. Wnt, BMP, TGFβ ve diğer sinyal yolu farklılaşma belirli soy23doğru itmeye düzenleyen faktörler desenli yöntemleri uygulayın. Burada açıklanan gibi unpatterned yöntemleri İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) için eğilimi yararlanmak ve insan embriyonik kök nöroektodermal lineage tarafından doğru ayırt etmek için hücreleri (hESCs)24varsayılan. Farklılaşma yaklaşık üç hafta sonra elde edilen organoids erken gelişen beyin gözlenir birkaç hücre tipleri içeren büyük, biomimetic neuroepithelial yapılar oluşur.

Organoids standart, besleyici-Alerjik PSC kültürlerden üreten ve bu organoids ZIKV ile hastalık için teknik tam olarak sunulur. Besleyici-Alerjik PSC’ler için gereken kodlamayla yöntemleri konusunda kılavuz bilgiler için lütfen önceki yöntemleri yayınları25,–26bakın. Ayrıca, virüs birden çok deneyler için tutarlı miktarda uygulamak için MOI önceden hesaplamak önemlidir. Bu bir enfeksiyon tedavi kaplaması orta, kuluçka ve immunostaining ardından Vero hücrelerinin yaparak yapılır. Açıklamaları ve yöntemleri bu tekniğin daha önce açıklanan19,27olmuştur.

Hedef izdiham % 50-%70, PSC kültür ulaştıktan sonra hücreler sonra ayrışmış ve ultra düşük ek 96-şey kalıplara toplanan. Hücreleri kök hücre xeno ücretsiz bakım medya (SCMM) 3 gündür sürdürülen ve bir sinir indüksiyon medya kültürü geri kalanı için dönüştürülür. Organoids 3 hafta boyunca ayrıştırılan bir kez enfeksiyon yapılabilir. Görüntüleri enfeksiyonu takip hafta boyunca düzenli olarak tercih ederek, araştırmacılar ilerici hücre ölümü ve organoid bozulma gözlemlemek olacaktır. Araştırmacılar da bu transkripsiyon yapmak için zaman ya da proteomik profil oluşturma organoids ayırmak. Cryosectioning ve lightsheet yöntemlerini görüntüleme için tavsiye edilir ve araştırmacılar yüksek düzeyde enfeksiyon ve özellikle organoids nöral progenitör hücre (NPC) nüfus içinde viral çoğaltma görmeyi bekleyebilirsiniz. Sonuçta, bu teknik araştırmacılar hızla düşük maliyetli ve sınırlı donanımları ile insan beyninin viral enfeksiyon mekanizmaları incelemek için izin verir.

Protocol

1. serebral Organoids oluşturma IPSC üzerinden / hESC 2D kültür (0 gün) Not: SCMM orta vitronectin veya Geltrex ile kök hücre (SC) bakım yapılan bu protokolü varsayar alt katman. Bir alternatif, yüksek protein kök hücre kültürü çalışmalarının medya kullanıyorsanız, bu organoid oluşumu işlemini başlatmadan önce geçiş SC kültürlere SCMM için en az iki pasajlar için tavsiye edilir. Protokol SC kültür yöntemleri ile Besleyici tabanlı test edilmemiştir. Kullanma normal SC bakım yöntemleri 25 , 26, – izdiham için kültürler getir. Bu kültür yöntemi ve hücre hatta bağlı olabilir bu genellikle 3-4 gün passaging sonra olsa. Not: 6-şey plaka yaklaşık 2 kuyulardan organoids tam 96-şey saçtan üretmek için gereklidir. Kültürleri yok algılanabilir farklılaşma ile sağlıklı koloni morfolojisi emin olmak için 10 X-20 X büyütme, aydınlık alan mikroskobu ile kontrol edin. Getirmek SCMM 37 ° C (Rock inhibitörü) bir sıcak su banyosu ve tezcan 50 mM Y-27632 50 µL şişe ve enzimatik dekolmanı reaktif için oda sıcaklığında 2 mL. Bir ultra düşük eki (ULA) U-alt 96 iyi plaka, çok kanallı bir P200 pipet ve bir 25 mL reaktif rezervuar hazırlayın. SCMM aliquot 45 mL 50 mL konik tüp ve 50 mm Y-27632 45 µL ekleyin. İyice triturating tarafından Mix. Vakum SCs içeren iki kuyu Aspire edin ve hızlı bir şekilde her şey P1000 pipet kullanmaya enzim-Alerjik dekolmanı reaktif 1 mL ekleyin. 4 dk. 37 ° C kuluçka plaka kuluçkaya Vakum arıtılmış kuyu Aspire edin ve enzimatik dekolmanı reaktif 1 mL P1000 pipet kullanarak her şey ekleyin. Incubate ek bir 5 dakika süreyle 37 ° C kuluçka plaka Plaka kaldırmak ve arıtılmış kuyu inceleyin. Birleştirilmiş hücreleri kırmak için plaka üzerinde hafifçe dokunun. Büyük hücreli kümeleri hala görünür durumdaysa, 2 ek dk. 37 plaka kuluçkaya ° C. yineleme kümeleri artık çıplak gözle görünür hale gelene kadar bu adımı. Hücreleri düzgün ayrışmış bir kez ayrılma enzimler etkisiz hale getirmek için her şey için SCMM 1 mL ekleyin. Hücre süspansiyon 50 mL konik tüp içinde 4 mL havuz ve küçük bir hücre sayımı için aliquot almak. Herhangi bir kalan, tedavi edilmeyen kuyular bakım tabak içinde 37 ° C kuluçka iade. Sayım sırasında hücre süspansiyon vasıl 300 x g 5 dakika süreyle santrifüj kapasitesi Hücreleri toplam sayısını belirlemek ve SCMM + Y-27632 miktarını hesaplamak 60.000 hücre/mL süspansiyon elde etmek için gerekli çözüm. Dikkatle vakum süpernatant Aspire edin ve SCMM + Y-27632 hesaplanan birim ekleme çözüm. 5-mL damlalıklı tek tip hücre süspansiyon sağlanması bir 5 – 10 kez karıştırın. Hemen hücre süspansiyon bir reaktif rezervuar aktarabilir ve 150 µL bir çok kanallı P200 pipet kullanarak ULA U-alt 96-şey plaka her kuyuya pipet. Bu 96 bireysel organoids, her başlangıçta 9.000 hücrelerinin oluşan üretir. Santrifüj plaka, 150 x g 1 dk. Plaka 37 ° C kuluçka makinesi içine yerleştirin ve 48 h. plaka rahatsız etmeyin 2. Serebral Organoid bakım (2 gün) SCMM hazırlamak 17 mL 17 ile µL 50 mm Y-27643 50 mL konik tüp içinde. Sıcak SCMM + Y-27632 37 ° C sıcak su banyosu içinde çözüm. Organoid plaka kuluçka makinesi almak ve bir çok kanallı P200 pipet 75 µL için küme kullanarak yavaş yavaş orta kadar kuyunun kenarından ilk satırda çizin. Orta çizilmiş bir kez hızlı bir şekilde gevşek hücreleri ve organoids yukarı kaldırmaya kuyunun içine orta arka sınırdışı. Her satır için bu işlemi yineleyin. Not: Bu teknik, bundan sonra anılacaktır olarak bir " dağılım, " hücresel artıkları ve organoid süspansiyon kaldırdı. Daha küçük enkaz süspansiyon, bir medya değişiklikle silinmesine izin kalırken organoid kuyu, altına hızla batıyor. Bu kültür sırasında hücresel enkaz dinlenme organoid önlemeye yardımcı olur. Sonra bütün wells dağınık, 15 için bekleyin s organoids her şey altına battı emin olmak için. Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde her şey çok kanallı P200 pipet kullanarak orta 75 µL Aspire edin ve atık bir rezervuar dağıtmak. Not: Çoğu kullanıcı normal yayınları sırasında zaman zaman bir organoid Aspire edin. Bu kabaca %1 zaman oluşabilir. Yeterli organoids deneysel zaman puan için hayatta kalmak emin olmak Lütfen planlamanızı buna göre yapın. Transfer SCMM + Y-27632 çözüm bir reaktif rezervuar içine ve 150 µL de çok kanallı P200 pipet kullanarak her organoid dağıtmak. Plaka geri 37 ° C kuluçka makinesi yerleştirin. 3. Serebral Organoid bakım (3. gün) SCMM 17 mL bu zaman olmadan Y-27643 37 ° c sıcak. Tüm kuyu organoid plaka yapımı için 100 µL ayarlamak çok kanallı P200 pipet ile dağıtmak (bkz. Adım 2.2). Organoids onların kuyu dibine battı emin olmak için bir dakika 15 s. Atık su deposu hazırlayacak ve bir kaynak rezervuar ısıtılmış SCMM transfer. Dikkatle her kuyudan orta 125 µL Aspire edin ve taze SCMM çok kanallı P200 pipet kullanarak 150 µL ile yerine. Plaka geri 37 ° C kuluçka makinesi yerleştirin. 4. Serebral Organoid bakım (gün 4 +) Not: bu düzenli bakım enfeksiyon kadar her gün yapmak. Gün 4 besleme başlamadan önce sinirsel indüksiyon (NI) orta hazırlamak. Tezcan 250 µL aliquot birlikte 2 mg/mL heparin, 5 mL şişe 100 X N-2 ek. Heparin, 100 X N-2 5 mL ve 5 mL 100 de 250 µL eklemek X MEM-NEAA DMEM 500 ml / F12 + GlutaMAX. Steril filtre 500 mL filtre karışık çözüm. Not: Kullanılmadığı zaman 4 ° C’de NI tutun; NI sürer ilâ iki hafta önce taze orta hazırlanmalıdır. NI orta 37 17 mL sıcak ° C. Tüm kuyu organoid plaka yapımı için 100 µL ayarlamak çok kanallı P200 pipet ile dağıtmak (bkz. Adım 2.2). Organoids onların kuyu dibine battı emin olmak için bir dakika 15 s. Atık su deposu hazırlayacak ve bir kaynak rezervuar ısıtılmış NI transfer. Dikkatle her kuyudan orta 125 µL Aspire edin ve taze NI çok kanallı P200 pipet kullanarak 125 µL ile yerine. Plaka geri 37 ° C kuluçka makinesi yerleştirin. 5. ZIKV ile Organoid enfeksiyon (~ gün 24) Not: farklılaşma, orada kablosuz yaklaşık 3 hafta sonrabüyük neuroepithelial yapıları ve rozetler görünür ZIKV enfeksiyon için son derece duyarlı olacak organoid içinde olacak. Getir Earle ' s 1 X dengeli tuz çözüm (EBSS), 1 X PBS ve NI 37 ° c sıcak su banyosunda. Dilute bilinen konsantrasyon ZIKV hedef enfeksiyona 1 X EBSS içinde çeşitlilik enfeksiyon (MOI). Not: Farklı MOIs titrations bir viral doz yanıt elde etmek için tavsiye edilir. Bu virüs suşu tarafından farklı olabilir; ATCC VR-1838 ve ATCC VR-1843 için tipik MOI 0,1 ve 10 arasında değerler). Tüm Orta iyi bir tek kanal P200 pipet kullanarak organoid dikkatli bir şekilde çıkarın. Hızlı bir şekilde her şey P200 çok kanallı pipet organoids yıkamak için kullanmaya 1 X PBS 200 µL eklemek. Tüm Orta iyi bir tek kanal P200 pipet kullanarak organoid dikkatli bir şekilde çıkarın. Hızlı bir şekilde 50 µL 1 X salt EBSS (sahte enfeksiyon) ya da iyi ve organoid tamamen sular altında emin olmak için ZIKV virüs çözümü ekleyin. Yineleme için çalışma için var olmak bulaştırmak için her organoid. İçin 2 h. 37 ° C kuluçka makinesi içine geri plaka yer Not: Bu süre değil önemli ölçüde etkisi rahatsız edilmeden organoids kıyasla onların büyüme için sahte enfekte organoids kuluçka. Yaklaşık 30 dk önce viral kuluçka tamamlanmış, aliquot 25 mL NI 50 mL konik tüp içine olduğunu ve 37 ° C sıcak su banyosunda getirmek. Viral pozlama tamamlandıktan sonra her şey için 1 X PBS 200 µL ile organoids yıkamak, organoids 15 s ve bir tek kanal P200 pipet kullanarak Kaldır 1 X PBS için sonra yerleşmek izin. Eklemek 200 µL her yeni NI, iyi ve geri kuluçka makinesi yerleştirin. İsteğe bağlı: için bir gün 0 saat noktası, organoids bir saat sonra enfeksiyon görüntüsü. Kültür dağılım yöntemini kullanarak her geçen gün 125 µL NI değiştirerek devam et (bkz. Adım 4). Bu bulaşıcı ZIKV parçacıklar içerir olarak harcanan kitle iletişim araçları ve ipuçları, uygun şekilde atın emin olun.

Representative Results

Organoid oluşumu gün boyunca, SC kültürleri % 50- birleşmesi, şekil 1(A-C)gösterildiği gibi oldukları günlük büyüme aşamasında olmalı. Kültürler ile farklı kenarları yuvarlatılmış kolonileri oluşturması gerektiğini ve kuyular şekil 1(D-E)farklılaşma açık olmalıdır. Farklılaşma meydana gelen, bir pick-için-tabak içinde etkilenen bölgelere organoids oluşturmadan önce en az bir gün temizlemek için Kaldır yapmak için önerilir. Kültür büyük bir bölümünü farklılaşmış, ilave bir geçiş yapmak, yeni bir şişe çözülme veya kök hücre kültürü teknikleri organoids saf kök hücre kültürleri tarafından kurulmuş olduğunu emin olmak için değiştirmek için gerekli olabilir. Olabilir rağmen hücre sayım sırasında gözlenen küçük toplamları ayrılma enzim-Alerjik ve enzimatik dekolmanı reaktifler tedavi kombinasyonu tarafından çoğunlukla tek hücrelere götürür. Sayım doğruluğunu etkileyebilir rağmen küçük toplamları varlığı organoid oluşumu, bozmaya görünmez. Bu örnek birden çok kez yapılır ve sayıları üzerinden % 20 oranında farklılık gösteriyorsa, hücreleri daha fazla singularize için ayrılma zamanı artırmak gerekli olabilir tavsiye edilir. Hücreleri tohumlari ve aşağı bir ULA U-alt 96-şey plaka (Şekil 2A) döndü sonra düz, yoğun sabıkası her kuyunun sayfasında bulunan bir hücreler olarak görünür. Hücrelerin yavaş yavaş önümüzdeki iki gün içinde toplamak. Mekanik Kuvvetleri gevşek oluşan toplama engel olabilecek gibi plaka bu 48 saat sırasında rahatsız etmek en iyisidir. İlk 10 gün için organoid çoğunlukla küresel kalır ve ~ 300 µm 600-800 µm (Şekil 2B) büyüyecek. Daha fazla gözlemlenebilir yapıları organoid 10 gün ve gün 20 arasında görünür başlar (Şekil 2C-E). Gündüzleri 24, araştırmacılar rozet gibi yapıları aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2F) yoluyla gözlemlemek gerekir. Kültür devam ederken, bu neuroepithelial yapılar miktar ve boyut olarak birkaç gün içinde (Şekil 2G) artabilir. Besleme sırasında araştırmacı her şey, altta özellikle ilk 2 hafta boyunca kültür toplama enkaz hatırı sayılır miktarda fark edeceksiniz. 2.2. adımda anlatılan dağılım tekniği çoğu birden çok akışı (Resim 3A) üzerinde biriken apoptotik enkaz önlemek için bu hücresel enkaz kaldırır. Bu enkaz ile görüntülemede engelleyebilir, gözlemlemek ve Enfeksiyon kaynaklı hücre ölümü ölçmek için daha zor bunu başarabilir miyim ve asimetrik farklılaşma etkileyebilecek komşu organoid için sinyal sağlayabilir. Eğer dağılım tekniği düzgün yapılır, bu olmalıdır (şekil 3B-C, 3D-E) azalır. Bu cryosections ya da organoids içinde şekillendirme kortikal yapısını incelemek için lightsheet görüntüleme yapmak için tavsiye edilir. Gün içinde 25 organoids, rozet yapıları ve ventrikül bölgeleri DAPI (şekil 4A) ve fosfo-vimentin (şekil 4B) Boyama açıkça görülebilir. TBR2 varlığı (şekil 4C) ara ataları, dışa göç öneriyor bir morfolojisi ile oluşturuyoruz olduğunu gösterir. MAP2 + (şekil 4D) nöronların her rozet dış bölgelerde doldurmak. Bu proteinler bir ventriküler bölge (VZ), subventricular bölgesi (SVZ), ara bölge (Iz) ve kortikal plaka (CP) her rozet içinde görselleştirebilirsiniz (şekil 4E, 4E’). Bir sonraki geliştirme aşamalarını incelemek için bu organoids kültür devam edebilirsiniz. Kortikal katman olarak organoid bu tür önemli değildir, ancak vivo içindeyaptığı gibi gliogenesis doğal geçiş çok meydana gelir. Bu hangi hücrelerin büyük bir bölümünü hızlı MAP2 ya da GFAP’nin gün 108 organoids içinde görülebilir (şekil 4F-ben). Kullanıcılar tarafından yaklaşık 3 gün sonra ZIKV enfeksiyon, viral MOI organoids (şekil 5A-B) uygulanan bağlı olarak farklılıklar organoid boyutunda görmek için beklemek. Bu 3 gün sonra Ayrıca olacak bir artış hücresel enkaz sahte wells karşılaştırıldığında virüslü Wells. Organoid boyutu bu farklılığı aşağıdaki haftadır, apart (şekil 5C-D) kırmak virüslü organoids başlamak kadar artacaktır. Deneyleri çeşitli bu noktada enfeksiyon mekanizmaları, viral RNA çıkarma ve cryosectioning (önerilen malzemeler tablo rapor antikorlar) de dahil olmak üzere araştırmak için kullanılır. Cryosectioning, kullanıcıların virüs neuroepithelial yapıları, apikal bölgede büyük bir varlığı ZIKV enfeksiyonu (şekil 6) nöral progenitör hücre (NPCs) bir duyarlılık düşündüren uyacaktır. Ayirt kesitli organoids, ayrıca caspase-3 ifadede i ciddi enfekte organoids (Şekil 7) bir artış gösterir. Resim 1 : Kök hücre koloni morfolojisi organoid oluşumu önce.Koloniler % 50- birleşmesi ayrılma tutarlı organoids çok sayıda üretmek için zaman nerede olması gerektiğini. (A) Sparse, son zamanlarda seribaşı kültürleri henüz günlük büyüme ulaşılmış faz ve birçok organoids üretmek değildir. (B) hücreleri uygun izdiham ulaştığınızda, ayrılma için hazırlar. Bu koloniler farklılaşma açık olduklarından emin olmak için kontrol önemlidir. (C) çok ileri alınır kolonileri aşırı izdiham ulaşacak ve organoid oluşumu için tavsiye edilmez. Bu eyalette kültürler ayırt hücreleri içeren olasılığı daha yüksektir. (D) koloni kenarları ayrı, tutarlı hücre morfolojisi ortasındaki yuvarlak hücre ile olmalı ve biraz hücrelerin kenarlarına doğru uzamış. (E) en az farklılaşma kültürlerde bulunması gerekir. Daha büyük, düzleştirilmiş hücreleri merkezleri veya kenarları kolonileri (beyaz ok uçları) gözlenir ve kültür daha kabaca % 1’yaparsanız, çekme Kaldır veya ek geçişleri tek tip kök hücre nüfus oluşturmak için yapılan önerilir.e.Jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig1large.jpg”hedef =”_blank”> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Zaman içinde beyin organoid büyüme. (A) 2D serebral organoids üretimi için bir şema PSC’ler xeno, besleyici boş ortamda yapılmaktadır. (B) ilk 8 gün boyunca, organoids çoğunlukla kaç tespit özelliği ile küresel kalacak. Organoid çapı yaklaşık 300 µm 500 µm. için (C-E) 10 gün aralığı olacaktır, daha net bölgeler organoids çevre algılanabilir olmaya başlar ve onların küresel şekli kaybedersiniz. Onlar boyutu yaklaşık 1 mm çapında, organoids üretmek için kullanılan hücre hatta büyük ölçüde bağlı olarak artmaya devam edecektir. (F) farklılaşma yaklaşık 20 gün sonra kullanıcıların çoğu organoids net periferik bölgelerinde neuroepithelial yapıları (siyah ok uçları) oluşumu uyacaktır. Bunlar o gelişmekte olan korteksin taklit apikal ve Bazal yapılarla bir yüzük benzeri Morfoloji var. (G) bu neuroepithelial yapıları büyümek ve yaklaşık 20-30 gün boyunca Boyutu’nda artırın devam edecektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Dağılım ile hücresel enkaz temizleme tekniği yem.Organoid büyüme sırasında hücre ölümü büyük miktarda olması, normal ve organoid Bankası çevreleyen hücresel enkaz birikimi için yol açabilir. (A) görülen dağılım tekniği araştırmacılar her besleme sırasında çoğu bu enkaz kaldırmak izin verir. Bunu bir çok kanallı P200 pipet kullanarak yapmak için yavaş yavaş kullanılan orta çizmek ve hızla organoid ve hücre artıkları süspansiyon kaldırmak için sınırdışı. Organoid hızlı bir şekilde hangi zamanda düzenli bir besleme yapılabilir kuyunun altına düşecek. Bir gün 6 organoid önce (B) ve (C) dağılım besleme önemli enkaz azaltma gösterdikten sonra örnekleri. Bu birkaç hafta için bir gün 18 organoid önce (D) ve (E) dağılım besleme sonra gösterildiği gibi devam eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Serebral organoids immünhistokimya ile karakterizasyonu.Serebral organoids Lightsheet görüntülerini oluşturan hücresel mimarisi için bir örnek sağlar için gösterilir. Gün 25, DAPI (A) , ve fosfor-Vimentin (B) gösterir bireysel rozet ve ventrikül bölgeleri, anılan sıraya göre. (C) TBR2 dışa göç vardır ara ataları ve MAP2 etiketleri (D) etiketleri kortikal plaka oluşan nöronlar. (E, E’) Bu proteinlerin kombinasyonu açıkça serebral organoid modellerinde Rekapitülasyon kortikal gelişim gösterir. (F-ben) 108 gün, gliogenesis GFAP’nin + ve organoid çoğunu doldurma MAP2 + hücre karışımı ile oluştu. VZ ventrikül bölge, SVZ = subventricular bölge, Iz = ara bölge, CP = kortikal plaka =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : Virüs bulaşmış organoids bozulma. Sahte ve ZIKV enfekte serebral organoids MOI, (A) parlak alan görüntülerini = 0,1 ve 10. Görüntüleri de 3 ve 6 gün sonrası enfeksiyon enfeksiyon (0 gün), sonra hemen alındı. (B-C) (B) sahte ve (C) ZIKV-MOI enfekte çevreleyen hücre artıkları görüntülerin aydınlık alan 10 serebral organoids 3 gün sonrası enfeksiyon =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6 : Cryosection ve ayirt, enfekte organoids.Gün 24 organoids ZIKV MOI, için maruz kalan 6 gün sonra = 0,1 ve cryosectioned. Bu aşamada, virüs nöral progenitör hücre ve Radyal glia bulunduğu ventrikül, subventricular ve ara bölgeleri, organoid, açık bir varlığı vardır. (A) nükleer boyama yoluyla bu neuroepithelial bölgeler (beyaz ok) açıkça izlenebiliyor üremelerine yüzük benzeri yapılar apikal yüzeyi çevresine çekirdeği yüksek yoğunluklu için. (B) için viral zarf boyama tarafından bir virüs Bu rozet yapıları (beyaz ok uçları) içinde nispeten yüksek bir varlığı gözlemleyebilirsiniz. Virüs çeşitli tanımlanamayan periferik hücrelerde mevcut küçük bir miktar olduğunu unutmayın. (C-D) MAP2 ya da diğer nöron özel gösteri nöronlar ile viral leke overlaid virüs bulaşması için görünmez kültürlerde mevcut olan lekeleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 7 : Caspase-3 ayirt enfekte organoid, i ciddi.Enfeksiyon sonra bir organoids içinde oluşan hücre ölümü mekanizmaları araştırmaya apoptotik göstergeleri kullanabilir. Bu örnekte, ZIKV MOI, gün 24 organoids sinin 6 gün sonra = 0,1 ve cryosectioned. (A) hastalık bulaşmamış tek organoids yok viral zarf göster (4 g 2 protein) ve i ciddi caspase-3 homeostatik apoptosis dokuda meydana gelen nedeniyle en az bir miktarda. (B) Infected rozet apoptosis, daha yüksek düzeyde göstermeye başlar. (C) şiddetli hastalık yolu ile 4 g de boyama 2 gösterilen rozet i ciddi caspase-3 bu bölgelerde yüksek düzeyde sergi eğilimindedir. Enfeksiyon önem ve i ciddi caspase-3 ifade içinde virüslü rozet arasında doğrudan bir ilişki vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

İnsan beyin organoids kullanan ZIKV enfeksiyon araştırmak için dikkate çeşitli uyarılar vardır. Bir önemli göz o organoid oluşumu ve yapısı içinden oluşturdular kök hücre satırdaki son derece bağlıdır. İsogenic mühendislik satırları da dahil olmak üzere hücre aralarını karşılaştırırken dikkat çekmek; birden çok subclones ve ideal olarak birden çok kök hücre hatları kullanarak sonuçlar yapmak en iyisidir. Ayrıca hücre hatlarında bu farklılıktan dolayı pilot deneyler uygun farklılaşma organoids içinde oluştuğunu emin olmak için tavsiye edilir. Neuroepithelial yapıları aydınlık alan mikroskobu tarafından görünür olsa da, aynı zamanda sinir ayırt etme belirteçleri PAX6 veya fosfo-vimentin gibi aramak için qRT-PCR veya cryosectioning deney için önerilmektedir.

Bir de organoids içinde aynı hücre kültürünü arasında önemli ölçüde değişkenlik öngörmelisiniz. Protokol unpatterned yapısı nedeniyle, neuroepithelial yapıları boyutunu ve sayısını bireysel organoids arasında değişebilir. Genellikle, bir en az iki büyük bekleyebilirsiniz (> D24 tarafından çapı 200 µm) organoid başına sinir rozet. Bu nedenle, enfeksiyon, üzerine organoid boyutunda değişiklik gözlenmesi gibi uzunlamasına çalışmalar özellikle aydınlatıcı olan. Toplu işlemleri arasında değişkenlik de, bunun en olası nedeni ile hatalı hücre sayımı veya tohum olmak ortaya çıkabilir. Bu birden çok kez yapmak ve hücre süspansiyon iyi ULA U-alt 96-şey plakalar tohum önce karışık emin olmak için tavsiye edilir.

Organoids ULA U-alt 96-şey tabak içinde kültür zaman plakaların kenarlarda önemli buharlaşma etkileri görmek planı. Bu kuyu PBS ile doldurun ve sadece merkezi 60 wells ile çalışmak idealdir. Buharlaşma nedeniyle dış Wells organoids daha fazla büyük olasılıkla onların büyüme ve farklılaşma etkiler merkezi olan farklı koşullara maruz kalacağı. Lütfen bu deneyler için gerekli organoids sayısı planlarken dikkate alın. Ayrıca, organoids kabaca 30 kültür orta renk değişikliği nedeniyle görünür olacak gün sonra 96-şey biçimi sarmak başlayacak. Son 30 gün organoids alarak planlama, organoids ULA 24-şey plakasına aktarmak için önerilir. Transfer yapmak için açılış organoids kendilerini çok daha büyük olması P1000 bahşiş kesmek için makas kullanın ve pipetting tarafından organoids transfer.

İnsan beyin organoids alanın açıkların ve hastalık anlayışı ilerleyen büyük potansiyele sahip. Araştırmacılar iletişim kuralı gerekli olarak değiştirmek için teşvik edilir. Örneğin, bir farklılaşma etkinliğini belirli hücre tipleri, onları viral etkileri bazı anatomik bölgeler üzerinde keşfetmek için izin doğru artırmak için desenlendirme faktörler uygulamak olabilir. ZIKV nörogelişimsel etkileri hala kötü anlaşılır ama bu yeni yaklaşım araştırmacılar enfeksiyon mekanizmaları araştıran bir erişilebilir, hızlı ve yüksek işlem hacmi yol verecektir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Priscilla L. Yang ve Dominique J. Burri, Harvard Tıp Okulu ilk yayılması ve ZIKV miktar ile yardım için teşekkür ederiz. Biz de Nathaniel D. Kirkpatrick görüntüleme destek için teşekkür etmek istiyorum. K.E. psikiyatrik araştırma ve Harvard kök hücre Enstitüsü Stanley Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Materials

Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 StemCell Technologies 5940 Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton.  Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR StemCell Technologies 5873
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase Gibco A11105-01 Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary
Y-27632 Selleck Chem S1049 Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) Gibco 10565-018 (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502-048
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) Gibco 11140-050
Heparin Sigma-Adrich H4784-1G Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) GE Healthcare Life Sciences SH30029.02
Stericup Filter (500mL) Millipore 220009-140
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom Corning 7007
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) Integra 4312
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ Rainin 17013810
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible Thermo Scientific 75007210
Culture Plate Centrifuge Rotor Thermo Scientific 75005706
Vero Cells ATCC CCL-81 For virus expansion, if necessary
Zika Virus (Uganda Strain) ATCC VR-1838 Other strains may be used
Zika Virus (Puerto Rico Strain) ATCC VR-1843 Other strains may be used
phospho-vimentin MBL D076-3 mouse polyclonal,  1:250 dilution
TBR2 Abcam ab23345 rabbit polyclonal, 1:300 dilution
MAP2 Novus NB300-213 chicken polyclonal, 1:1500 dilution
GFAP Cell Signaling Technologies CST12389S rabbit polyclonal, 1:200 dilution
D1-4G2 flavivirus envelope protein EMD Millipore MAB10216 mouse monoclonal, 1:500 dilution
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technologies 9661 rabbit polyclonal, 1:200 dilution
488 anti-mouse IgG Thermo Fisher A-11001 goat polyclonal, 1:1000
594 anti-rabbit IgG Thermo Fisher A-11037 goat polyclonal, 1:1000 dilution
647 anti-chicken IgY Thermo Fisher A-21449 goat polyclonal, 1:1000 dilution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
  2. Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
  3. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
  4. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
  5. Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
  6. Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584 (2016).
  7. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
  8. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
  9. Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
  10. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
  11. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
  12. Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).
  13. Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
  14. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204 (2016).
  15. Li, X. -. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
  16. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
  17. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
  18. Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
  19. Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
  20. Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
  21. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
  22. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  23. Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  24. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
  25. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
  26. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
  27. Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).

Tags

Zika VirusCerebral OrganoidsStem CellIn Vitro ModelCell CultureCell DissociationROCK InhibitorHigh-throughput AssayCRISPRDrug ScreeningVirus Pseudotyping

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Salick, M. R., Wells, M. F., Eggan, K., Kaykas, A. Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids. J. Vis. Exp. (127), e56404, doi:10.3791/56404 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image