Целеуказание тиолы цистеина в Vitro участкам гликозилирования рекомбинантных белков

Хранить оперированных кальция (Ca^{2 +}) вход (SOCE) является основным путь, по которому иммунные клетки take up Ca^{2 +} от внеклеточного пространства в цитозоль. В Т-лимфоцитов Т-клеток рецепторов, расположенных на мембране плазмы (PM) связывать антигены, которые активируют белка тирозин киназ (обзор в ^1,2,3). Фосфорилирование Каскад приводит к активации фосфолипазы γ (PLCγ), который впоследствии опосредует гидролиза мембраны фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (пункт₂) в диацилглицерол и инозитол 1,4,5-trisphosphate (IP₃ ). IP₃ является небольшой diffusible messenger, который привязывается к IP₃ рецепторов (IP₃R) в эндоплазматический ретикулум (ER) тем самым открыв этот рецептор канал и разрешительные Ca^{2 +} течь вниз градиент концентрации от ER просвет в цитозоле (обзор в ⁴). Рецептор сигнализации от G-белка в сочетании и тирозин киназы рецепторов в различных других типов свинца возбудимых и не возбудимых клеток же производства IP₃ и активации IP₃Rs.

Из-за ограниченных Ca^{2 +} емкость ER, IP₃-опосредованной выпуска и результирующая увеличение цитозольной Ca^{2 +} только является несохраняемым; Однако, это истощение ER Люминал Ca^{2 +} глубоко эффекты стромальные взаимодействия молекулы-1 (STIM1), тип-я трансмембранного (TM) белков чаще встречаются на ER мембраны ^5,6,7. STIM1 содержит люмен ориентированный Ca^{2 +} зондирования домен состоит из пары EF-рука и стерильные α-мотив (EFSAM). Три ориентированных на цитозольной биспиральных домены отделены от EFSAM одного домена ТМ (обзор в ⁸). После ER Люминал Ca^{2 +} истощение EFSAM подвергается дестабилизации в сочетании олигомеризации ^7,9 , который вызывает структурных перестроек ТМ и домены биспиральных ¹⁰. Эти структурные изменения кульминацией треппинга STIM1 ER-PM развязок ^11,12,13,14 через взаимодействие с вечера фосфоинозитидов ^{15, 16} и Orai1 субблоков ^17,18. Orai1 белки являются субблоков вечера, которые собираются форме Ca^{2 +} каналы ^19,20,21,22. STIM1-Orai1 взаимодействий на перекрестках ER-PM содействовать открытой Ca^{2 +} релиз активирован Ca^{2 +} (CRAC) канал конформации который позволяет движение Ca^{2 +} в цитозоль от высоких концентраций внеклеточного пространства. В иммунных клеток, устойчивый цитозольной Ca^{2 +} фасады каналам Крак побудить Ca^{2 +}– Кальмодулин/кальциневрина зависимых дефосфорилирование ядерного фактора активированные Т-клеток, который впоследствии проникает в ядро и начинает регуляцию генов, поощрение Т-клеток активации ^1,3. Процесс активации Крак канал STIM1 ^23,24 через агонист индуцированной ER Люминал Ca^{2 +} истощения и результате устойчивой цитозольной Ca^{2 +} высота собирательно именуются SOCE ²⁵. Жизненно важную роль SOCE в Т-клеток проявляется исследования демонстрируют, что наследственные мутации в STIM1 и Orai1 может вызвать тяжелый комбинированный иммунодефицит синдромы ^{3,19,26, 27}. EFSAM инициирует SOCE после зондирования ER-просветный Ca^{2 +} истощение через потери Ca^{2 +} координации на канонической EF-рука, в конечном счете приводит к дестабилизации в сочетании самостоятельной ассоциации ^{7, 28,29}.

Гликозилирование является ковалентной привязанность и обработка олигосахарида структур, также известный как гликаны, через различные биосинтетических шаги в ER и Гольджи (обзор в ^30,,32–³³). Существует два преобладающего типа гликозилирования у эукариот: N-связанные и O-связаны, в зависимости от конкретных amino acid и преодоление связь атома. В N– гликозилирования, гликанов прикрепляются к боковой цепи Амида в АСЦ, и в большинстве случаев, шаг возбуждение возникает в ER как полипептидной цепи перемещается в Люмене ³⁴. На первом шаге N– гликозилирования является передача четырнадцать сахара ядра структура, состоящая из глюкозы (КЗС), манноза (Man) и N– acetylglucosamine (GlcNAc) (т.е. Glc₃человек₉GlcNAc₂) от ER мембранных липидов, ^35,oligosaccharyltransferase³⁶. Дальнейшие шаги, такие, как расщепление или передаче остатков глюкозы, в ER катализируемые конкретную основу и гликозидазы. Некоторые белки, которые оставляют ER и переехать в Гольджи можно дополнительно обработанных ³⁷. O– гликозилирования относится с добавлением гликаны, обычно в боковой цепи гидроксильной группы Ser или чет остатков, и это изменение происходит полностью в комплекс Гольджи ^33,34. Существует несколько O– glycan структур, которые могут быть сделаны N– acetylglucosamine, Фукоза, галактоза, и сиаловая кислота с каждым моносахаридов последовательно добавлены ³³.

Хотя без конкретных последовательность была определена в качестве предпосылки для многих типов O– гликозилирования, общую последовательность консенсуса был связан с N-связанных изменений: Asn-X-Ser/Чет/КМС, где X может быть любой амино кислоты за исключением Pro ³³. STIM1 EFSAM содержит два из этих консенсуса N– гликозилирования сайтов: Asn131-Trp132-Thr133 и Asn171-Thr172-Thr173. Действительно предыдущие исследования показали, что EFSAM может быть N– гликозилированного в клетках млекопитающих в Asn131 и Asn171^{, 3839,40,41}. Однако, предыдущие исследования последствий N– гликозилирования на SOCE были несовместимы, предлагая подавлены, потенцированные или не влияет на этот столб-поступательные изменения на SOCE активации ^38,= «внешней» > 39^40,,41. Таким образом исследования на основные биофизические, биохимические и структурные последствия EFSAM N– гликозилирования жизненно важное значение для понимания нормативных последствий этой модификации. Из-за требования для высоких уровней однородных белков в этих экспериментах в пробирке сайт селективный подход к ковалентно придают глюкоза постановление EFSAM был применен. Интересно, что Asn131 и Asn171 гликозилирования вызвало структурные изменения, которые сходятся в пределах EFSAM ядро и усиливают биофизические свойства, способствующие STIM1-опосредованной SOCE ⁴².

Химическая приверженность glycosyl групп Cys тиолы был хорошо установленными плодотворную работу, которая впервые продемонстрировал полезность этого фермента свободный подход к пониманию участкам воздействия гликозилирования на функции белка ^{43 , 44}. совсем недавно и в отношении STIM1, остатки Asn131 и Asn171 были мутировал Cys и glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] была использована для ковалентно связать бесплатно тиолы ⁴²глюкозы. Здесь мы опишем этот подход, который не только использует для включения конкретных остатки Cys сайт для модификации мутагенеза, но также применяется решение ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопия быстро оценить изменения эффективности и структурной возмущений в результате гликозилирования. Особенно эта общая методология легко адаптируется для изучения последствий либо O– или N– гликозилирования любого recombinantly производства белка.