Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Speichern betriebenen Kalzium (Ca^{2 +}) Eintrag (SOCE) ist der große Weg durch die Immunzellen Ca^{2 +} aus dem extrazellulären Raum in das Zytosol nehmen. In T-Lymphozyten binden T-Zell-Rezeptoren auf der Plasmamembran (PM) Antigene die Protein-Tyrosin-Kinasen (rezensiert in ^1,2,3) aktivieren. Eine Phosphorylierung Kaskade führt zur Aktivierung der Phospholipase-γ (PLCγ), die anschließend die Hydrolyse von Membran Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate (PIP₂) in Diacylglycerol und Inositol-1,4,5-Trisphosphate (IP-_{3 vermittelt} ). IP-₃ ist ein kleines diffusiblem Bote die IP₃ an Rezeptoren (IP-₃R) auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER bindet) damit dieser Rezeptor-Kanal öffnen und schönem Ca^{2 +} nach unten das Konzentrationsgefälle aus der Notaufnahme fortgesetzt Lumen zu dem Zytosol (rezensiert in ⁴). Rezeptor Signalisierung von G-Protein gekoppelt und Tyrosin-Kinase-Rezeptoren in einer Vielzahl von anderen erregbaren und nicht erregbaren Zelle Arten führen die gleiche Produktion von IP-₃ und Aktivierung von IP₃Rs.

Aufgrund der endlichen Ca^{2 +} Speicherkapazität von der Notaufnahme, die IP-₃-vermittelte Freisetzung und daraus resultierende Erhöhung der cytosolischen Ca^{2 +} ist nur vorübergehend; diese Erschöpfung des ER luminalen Ca^{2 +} Effekte jedoch zutiefst Stromazellen Interaktion Molekül-1 (STIM1), eine Art-ich transmembranen (TM) Protein meist zu finden, auf die ER Membran ^5,6,7. STIM1 enthält eine Lumen-orientierte Ca^{2 +} Fernerkundung Domäne bestehend aus ein paar EF-Hand und sterile α-Motiv (EFSAM). Drei cytosolische orientierten coiled-Coil-Domänen sind von EFSAM durch die TM-Einzeldomäne (rezensiert in ⁸) getrennt. Auf ER luminalen Ca^{2 +} Erschöpfung erfährt EFSAM eine Destabilisierung gekoppelt Oligomerisierung ^7,9 wodurch strukturelle Umstellungen der TM und coiled-Coil-Domänen ¹⁰. Diese strukturellen Veränderungen münden in ein Überfüllen des STIM1 bei ER-PM Kreuzungen ^11,12,13,14 durch Interaktionen mit PM Phosphoinositides ^{15, 16} und Orai1 Untereinheiten ^17,18. Orai1 Proteine sind die PM-Untereinheiten die Form Ca^{2 +} Kanäle ^19,20,21,22montieren. Die STIM1-Orai1-Interaktionen an ER-PM Kreuzungen erleichtern eine offene Ca^{2 +} Freigabe aktiviert Ca^{2 +} (CRAC) Kanal Konformation ermöglicht die Bewegung von Ca^{2 +} in der Zellflüssigkeit aus den hohen Konzentrationen von der Extrazellulärraum. In Immunzellen, die nachhaltige cytosolischen Ca^{2 +} Höhen CRAC Dienstweg induzieren die Ca^{2 +}– Calmodulin/Calcineurin abhängigen Dephosphorylation des nuklearen Faktors der aktivierten T-Zellen die Folge den Kern tritt und transkriptionelle Regulierung der Gene, die Förderung der T-Zell-Aktivierung ^1,3beginnt. Der Prozess der CRAC Kanal Aktivierung durch STIM1 ^23,24 über Agonist-induzierte ER luminalen Ca^{2 +} Erschöpfung und die daraus resultierende nachhaltige cytosolischen Ca^{2 +} Höhe wird Kollektiv SOCE ²⁵bezeichnet. Die entscheidende Rolle der SOCE in T-Zellen ist offensichtlich durch Studien, die zeigen, dass vererbbare Mutationen in STIM1 und Orai1 dazu führen, Severe Combined Immunodeficiency Syndrome ^3,19,26, dass können ²⁷. EFSAM initiiert SOCE nach sensing ER luminalen Ca^{2 +} Erschöpfung über den Verlust von Ca^{2 +} Koordinierung auf die kanonische EF-Hand, letztlich zu der Destabilisierung gekoppelt Selbstassoziation ^{7, 28,29}.

Glykosylierung ist die kovalente Bindung und Verarbeitung von Oligosaccharid Strukturen, auch bekannt als Glykane, durch verschiedene biosynthetischen Schritte in der ER und Golgi (rezensiert in ^30,32,33). Es gibt zwei vorherrschende Arten der Glykosylierung in Eukaryoten: N-verknüpften und O-verbunden, abhängig von der spezifischen Aminosäure und Atom überbrücken die Verknüpfung. In N– Glykosylierung Glykane Seite Kette Amid von Asn befestigt sind und in den meisten Fällen die Einleitung Schritt erfolgt in der Notaufnahme als das Polypeptid Kette bewegt sich in das Lumen- ³⁴. Der erste Schritt der N– Glykosylierung ist die Übertragung einer vierzehn-Zucker Kern-Struktur, bestehend aus Glukose (Glc), Mannose (Mann) und N– Acetylglucosamin (GlcNAc) (d. h. Glc₃Man₉GlcNAc-₂) aus einem ER Membran-Lipid durch eine Oligosaccharyltransferase ^35,36. Weitere Schritte, wie Dekolleté oder Übertragung von Glukose Rückstände sind in der Notaufnahme von spezifischen Glycosidases und Glycosyltransferases katalysiert. Einige Proteine, die ER verlassen und bewegen in die Golgi können weiter verarbeiteten ³⁷sein. O– Glykosylierung bezieht sich auf die Zugabe von Glykoproteinen, in der Regel auf der Seite Kette Hydroxylgruppe des Ser oder Thr Rückstände, und diese Änderung tritt ganz in die Golgi-Komplex ^33,34. Gibt es mehrere O– Glykan-Strukturen, die von N– Acetylglucosamin, Fucose, Galaktose gebildet werden können, und Sialinsäure Säure mit jeder Monosaccharid hinzugefügt sequenziell ³³.

Während keine bestimmte Reihenfolge als Voraussetzung für viele Arten von O– Glykosylierung identifiziert wurde eine gemeinsame Konsensussequenz Nzugeordnet wurde-Änderung verbunden: Asn-X-Ser/Thr/Cys, wo X kann jede Aminosäure sein mit Ausnahme von Pro- ³³. STIM1 EFSAM enthält zwei dieser Konsens N– Glykosylierung Seiten: Asn131-Trp132-Thr133 und Asn171-Thr172-Thr173. In der Tat haben frühere Studien gezeigt, dass EFSAM N– glykosylierten in Säugerzellen bei Asn131 und Asn171 ^38,39,40,41sein kann. Jedoch frühere Studien der Folgen der N– Glykosylierung auf SOCE inkongruent gewesen, unterdrückt was darauf hindeutet, potenzierte oder keinen Einfluss durch diese Post-translationale Modifikation am SOCE Aktivierung ^38,= “Xref” > 39^,40,41. Forschung über die zugrunde liegenden biophysikalischen, biochemischen und strukturelle Folgen der EFSAM N– Glykosylierung unbedingt so verstehen die rechtlichen Auswirkungen dieser Änderung. Aufgrund der Voraussetzung für hohe homogene Proteine in diesen in-vitro- Experimenten wurde eine Website selektiv kovalent Glukose Moieties EFSAM beimessen angewendet. Interessant ist, verursacht Asn131 und Asn171 Glycosylation Strukturveränderungen, die innerhalb des EFSAM Kerns konvergieren und verbessern die biophysikalischen Eigenschaften, die STIM1-vermittelten SOCE ⁴²zu fördern.

Die chemische Befestigung der a1 Gruppen mit Cys Thiole hat durch eine Samen-Arbeit etabliert, die die Nützlichkeit dieser enzymfreien Ansatz zum Verständnis der standortspezifischen Auswirkungen der Glykosylierung auf Protein-Funktion ⁴³ erstmals nachgewiesen ^{, 44}. jüngerer Zeit und in Bezug auf STIM1, die Asn131 und Asn171 Rückstände waren, Cys mutiert und glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] wurde verwendet, um Glukose kovalent mit kostenlosen Thiole ⁴²zu verknüpfen. Hier beschreiben wir dieses Konzept bei dem nicht nur Mutagenese benutzt Website bestimmte Cys Rückstände für Änderung zu integrieren, sondern gilt auch Lösung Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie schnell Änderung Effizienz und strukturelle bewerten Störungen durch die Glykosylierung. Insbesondere diese allgemeine Methodik ist leicht anpassbar Studie zu den Auswirkungen der beiden O– oder N– Glykosylierung eines rekombinant Protein produziert.