JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
日本語

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/56302
, , , , ,
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry,University of Western Ontario

Summary

糖タンパク質の生化学的および構造解析では、均質な試料の比較的大量を必要とします。反応システイン チオール化合物をターゲットに細菌から精製組換えタンパク質の部位特異的糖鎖の効率的な化学的方法を紹介します。

Abstract

間質相互作用分子 1 (STIM1) は型-私膜貫通型タンパク質は、小胞体 (ER) と膜 (PM) に位置しています。小胞体 STIM1 プリンシパル Ca2 +シグナリング プロセスです免疫反応を駆動する作動させたカルシウム (Ca2 +) のエントリを格納として知られているプロセスの午後 Orai1 チャネルの活性を調節します。STIM1 は、ドメイン内で Ca2 +センサー分子の 2 つの内腔 Asn サイトで翻訳後修飾N– グリコシル化反応を受けます。しかし、生化学、生物物理、 Nグリコ STIM1 の構造生物学的効果が同種のN– 糖タンパク質の高レベルが容易に取得できないのため最近までよくわかっていないと。ここでは、特定の蛋白質サイト該当するタンパク質の構造と機構の糖鎖の根本的な効果を理解するために糖鎖のついた体外化学アプローチの実装について述べる.ソリューションの核磁気共鳴分光法を用いた単一サンプルのブドウ糖添付ファイルの構造の結果だけでなく、変更の両方の効率を評価する.このアプローチは、自然は、無数の糖蛋白質を研究する容易に適合できます。

Introduction

運営のカルシウム (Ca2 +) を格納エントリ (SOCE) が主要な経路で、免疫細胞は、細胞質への細胞外スペースから Ca2 +を取る。T リンパ球の細胞膜 (PM) に位置する T 細胞受容体は抗原蛋白質のチロシンのキナーゼ ( 1,2,3見直し) を有効にするをバインドします。リン酸化カスケード ホスホリパーゼ-γ (PLCγ) その後ジアシルグリセ ロールとイノシトール 1,4,5-三リン酸 (IP3 にホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) 膜の加水分解反応を媒介するの活性化につながる).IP3は、IP3受容体に結合 (IP3R) 小胞体 (ER) にこの受容体チャネルを開くし、Ca2 +を許可に流れる小胞体から濃度勾配を小さな拡散性メッセン ジャー(文献4) 細胞質へルーメン。受容体 G タンパク共役型とさまざまな他の興奮性および非興奮性細胞型鉛の受容体型チロシンキナーゼから IP3の同じ生産し IP3Rs の活性化。

有限 Ca2 +の容量 ER、IP3のため-仲介されたリリースと細胞内 Ca2 +の増加は遷移的です。ただし、この枯渇、小胞体内腔 Ca2 +深く間質相互作用分子 1 (STIM1) 型の効果-私は膜貫通 (TM) タンパク質は小胞体膜5,6,7主発見します。STIM1 にはルーメン指向 Ca2 +センサー ドメイン EF 手ペアと滅菌 α-モチーフ (EFSAM) が含まれています。(文献8) 単一の TM ドメインで EFSAM から 3 つのゾル性細胞質指向コイルド コイル ドメインが分かれています。小胞体内腔 Ca2 +枯渇、時に、EFSAM は TM とコイルド コイル ドメイン10の構造語順換えを引き起こす不安定化共役重合7,9を経る。これらの構造変化の ER PM 接合11,12,13,14 PM イノシトールリン脂質15,との対話を通じて STIM1 のトラップで絶頂に達する16と Orai1 サブユニット17,18。Orai1 タンパクは、フォーム Ca2 +チャンネル19,の20,21,22にアセンブルする PM サブユニットです。ER PM 接合で STIM1 Orai1 の相互作用を容易にする、開いて Ca2 +活性化リリース Ca2 + (クラック) チャネルの構造から高濃度の細胞質への Ca2 +の動きを可能にする、細胞外スペース。免疫細胞の CRAC チャネルを介して持続的なゾル性細胞質の Ca2 +標高は、Ca2 +-カルモデュリン/カルシニューリン依存の脱燐酸化活性化 T 細胞の核に入るその後核因子を誘導してT 細胞活性化1,3を促進する遺伝子の転写調節を開始します。STIM1 23,24アゴニストによる小胞体内腔 Ca2 +の枯渇を経由して結果持続的な細胞内 Ca2 +上昇 CRAC チャネル活性化のプロセスは、SOCE 25総称して呼びます。SOCE T 細胞の重要な役割は、STIM1 の Orai1 変異が重症複合免疫不全症候群3,19,26,を引き起こす可能性を示す研究によって明白である27です EFSAM は最終的に自己会合の不安定化結合7,につながる、正規の EF ハンドで Ca2 +調整の損失を介して小胞体内腔 Ca2 +枯渇を検出後 SOCE を開始。28,29。

グリコシル化反応、キャラクタリゼーションとオリゴ糖構造、小胞体とゴルジ体 ( 30,32,33見直し) の様々 な生合成手順をとして知られている糖鎖の処理です。真核生物における糖鎖の 2 つの支配的なタイプがある: N-リンクとO-リンクすると、特定のアミノ酸とリンケージをブリッジ原子によって。糖鎖、糖鎖を asn、側鎖のアミドに添付し、ほとんどのケースで開始ステップが ER で発生したポリペプチド鎖にルーメン34に移動します。糖鎖の最初のステップはから成っている (Glc) グルコース、マンノース (男) とn-アセチルグルコサミン (GlcNAc) (すなわち Glc3男9GlcNAc2)ER から 14 砂糖コア構造の転送酵素35,36による膜脂質。胸の谷間やグルコース残基の転送など、これ以降の手順は、小胞体の特定のグリコシダーゼと糖転移酵素によって触媒されます。いくつかのタンパク質は小胞体とゴルジ装置に移動は加工37をさらにすることができます。O糖鎖は通常 Ser または Thr の残基の側鎖水酸基に、糖鎖の付加、ゴルジ複合体33,34完全にこの変更が発生します。ガラクトース、フコース、 n-アセチルグルコサミン作ることができるいくつかのO型糖鎖構造があり、各単糖とシアル酸は33を順次追加。

一般的なコンセンサス配列をNに関連付けられている多くの種類O糖鎖修飾のための前提条件として特定の順序が特定されていない中-リンク修正: Asn-X-Ser/木/システインは、X が任意のアミノ酸をすることができます除いてプロ33。STIM1 EFSAM にはコンセンサスN– 糖鎖がこれらの 2 つが含まれています: Asn131-Trp132-Thr133 と Asn171-Thr172-Thr173。確かに、以前の研究では、EFSAM が Asn131、Asn171 38,39,40,41哺乳類細胞における糖鎖のNをすることができますを示しています。しかし、SOCE に糖鎖の結果の前の研究が一致されている、抑制を示唆増強または SOCE 活性化38,のこの翻訳後修飾による影響なし「外部参照」を = > 39,40,41。したがって、EFSAM N糖鎖の基になる生物物理・生化学・構造の影響に関する研究は、この変更の規制の影響を理解することが重要です。これらの in vitro実験の均質な蛋白質の高レベルの要件のため EFSAM に共有結合糖鎖を付けるサイト選択的なアプローチが適用されました。興味深いことに、Asn131 と Asn171 の糖鎖 EFSAM コア内で収束し、STIM1 を介した SOCE 42を促進する生物物理特性を高める構造の変化の原因。

糖グループのシステインのチオール基の化学添付ファイルはまずタンパク質関数43グリコシル化反応のサイト固有の効果を理解するこの酵素無料アプローチの有用性を示した種子の仕事によって確立されています。,44。 最近、STIM1 に関して Asn131 と Asn171 残基がシステインに変異したと共有無料チオール42にグルコースをリンクする glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] が使用されました。ここでは、突然変異誘発を使用して、サイトの変更、特定のシステイン残基を組み込むだけでなく、急速に変更の効率化と構造の両方を評価するためにソリューションの核磁気共鳴 (NMR) 分光法もこのアプローチについて述べる糖付加の結果として摂動。特に、この一般的な方法は、簡単にどちらかのO– の効果を研究に適応またはいずれかのN-グリコシル recombinantly 蛋白質を生産します。

Protocol

1 ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)-システインの細菌ペット-28 a の発現ベクターへの取り込みのサイト指示された突然変異誘発を介した。。 260 0.020 インチ (μ g/mL) cm -1 の紫外線 (UV) 吸光係数を使用してペット-28 a ベクトル (すなわち二重鎖 DNA) の濃度を決定する nm。 合成の各の Cys 変異補完 mutagenic プライマーのペア 私) 一塁のミスマッチや 15 ヌクレオチド後テン?…

Representative Results

このアプローチの最初のステップは、ブドウ糖 5 山地 EFSAM を使用して変更可能なことができるシステイン残基に候補糖残基の変異体には内因性のシステイン残基がないので特別な考慮事項を前に可能にする必要はありません必要があります、突然変異誘発。ただし、ネイティブのシステイン残基は、記述されている化学を実行する前に非変更可能な残基に変異する必…

Discussion

タンパク質の糖鎖修飾は翻訳後修飾糖が共有結合ポリペプチド アミノ酸側鎖に結合を通して主に接続されています。哺乳類のタンパク質の 50% がグリコ54、どこ糖蛋白質は生体分子結合親和性を変更することから効果の多様な範囲を持つことができますその後、蛋白質折りたたみ、チャネルの利用状況の変更、ターゲットに影響を与える劣化と携帯 (33の見?…

Acknowledgements

この研究は、自然科学と工学研究会のカナダ (時は PBS に 05239) のためのカナダの財団によって支えられた革新/オンタリオ研究基金 (する時は PBS)、前立腺がんと戦う財団 – (時は PBS) にお父さんとオンタリオ州の telus 社のソフトウェアに乗る大学院奨学金 (Y.J.C.、n. s.)。

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Cysteine ThiolsSite-specific GlycosylationRecombinant ProteinsStructural BiologyGlycosylation PatternsDisease TherapyPCR MutagenesisDPN1 DigestionProtein Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image