Targeting dei tioli cisteina per in Vitro site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti

Negozio gestito calcio (Ca^{2 +}) voce (SOCE) è la via principale, in cui le cellule immunitarie prendono il Ca^{2 +} dallo spazio extracellulare nel cytosol. Nei linfociti T, cellule T recettori situati sulla membrana plasmatica (PM) legano gli antigeni che attivano proteine tirosin chinasi (rivisto in ^1,2,3). Una cascata di fosforilazione conduce all’attivazione di fosfolipasi-γ (PLCγ), che successivamente ha trasmesso l’idrolisi di membrana fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP₂) in diacilglicerolo e inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP₃ ). IP₃ è un piccolo messaggero diffusibile che si lega ai IP₃ recettori (IP₃R) il reticolo endoplasmatico (ER) quindi aprire questo canale del ricevitore e permettendo Ca^{2 +} a fluire verso il basso la pendenza di concentrazione dall’ER lumen al cytosol (rivisto in ⁴). Segnalazione da accoppiati a proteine G e recettori tirosina-chinasi in una varietà di altre cellule eccitabili e non eccitabili tipi piombo per la produzione stessa di IP₃ e l’attivazione di IP₃Rs del ricevitore.

A causa del Ca^{2 +} deposito capacità limitata dell’ER, IP₃-rilascio mediato e aumento risultante in Ca citosolico^{2 +} è solo temporaneo; Tuttavia, questo svuotamento del ER luminal Ca^{2 +} effetti profondamente stromal interazione molecola-1 (STIM1), un tipo-io transmembrana (TM) proteina trovata principalmente sul ER membrana ^5,6,7. STIM1 contiene un lume-oriented Ca^{2 +} rilevamento dominio costituito da una coppia di EF-hand e sterile di α-motivo (EFSAM). Tre citosolico orientato arrotolato-arrotola domini sono separati da EFSAM dal singolo dominio TM (rivisto in ⁸). Al momento di svuotamento^{2 +} ER luminal Ca, EFSAM subisce una destabilizzazione-accoppiato oligomerizzazione ^7,9 che provoca riarrangiamenti strutturali della TM e arrotolato-arrotola domini ¹⁰. Questi cambiamenti strutturali culminano in un intrappolamento di STIM1 ER-PM giunzioni ^11,12,13,14 attraverso interazioni con PM phosphoinositides ^{15, 16} e Orai1 subunità ^17,18. Orai1 proteine sono le subunità di PM che assemblano per formare Ca^{2 +} canali ^19,20,21,22. Facilitano le interazioni di STIM1-Orai1 alle giunzioni di ER-PM una Ca^{2 +} sblocco attivato Ca^{2 +} (CRAC) canale conformazione aperta che consente lo spostamento di Ca^{2 +} nel citosol da alte concentrazioni della spazio extracellulare. In cellule del sistema immunitario, il citosolico Ca^{2 +} elevazioni continue attraverso canali di CRAC inducono il Ca^{2 +}– calmodulina/calcineurina dipendente defosforilazione del fattore nucleare delle cellule di T attivate che successivamente entra nel nucleo e inizia la regolazione trascrizionale di geni promuovendo l’attivazione delle cellule T ^1,3. Il processo di attivazione del canale CRAC di STIM1 ^23,24 via indotta da agonisti ER luminal Ca^{2 +} lo svuotamento e la risultante citosolico Ca^{2 +} elevazione continua è collettivamente denominato SOCE ²⁵. Il ruolo vitale dei SOCE in cellule di T è evidente da studi che dimostrano che le mutazioni ereditabili in Orai1 e STIM1 possono causare immunodeficienza combinata grave sindromi ^{3,19,26, 27}. EFSAM avvia SOCE dopo rilevamento luminal ER Ca^{2 +} svuotamento tramite la perdita di Ca^{2 +} coordinamento presso la canonica EF-hand, infine conducendo alla destabilizzazione-accoppiato autoassociazione ^{7, 28,29}.

La glicosilazione è il legame covalente ed elaborazione di strutture oligosaccaride, noto anche come glicani, attraverso vari passaggi biosintetici in ER e Golgi (rivisto in ^30,32,33). Ci sono due tipi predominanti di glicosilazione negli eucarioti: N-collegati e O-collegato, a seconda delle specifiche dell’aminoacido e atomo colmare il sollevatore. In N– glicosilazione, glicani sono associati l’ammide di catena laterale di Asn, e nella maggior parte dei casi, il passo di iniziazione si verifica nell’ER come polipeptide catena si muove nel lume ³⁴. Il primo passo di N– glicosilazione è il trasferimento di una struttura di nucleo di quattordici-zucchero composto da glucosio (cromatografia gaseoliquido), mannosio (uomo) e N– acetilglucosamina (GlcNAc) (cioè Glc₃Man₉GlcNAc₂) da un ER dei lipidi di membrana da un oligosaccharyltransferase ^35,36. Ulteriori passi, come la scissione o il trasferimento di residui di glucosio, vengono catalizzate al pronto soccorso di glicosiltrasferasi e specifiche glicosidasi. Alcune proteine che lasciano l’ER e spostare nel Golgi possono essere ulteriormente trasformati ³⁷. O– glycosylation si riferisce all’aggiunta di glicani, solitamente per il gruppo dell’idrossile di catena laterale dei residui Ser o Thr, e questa modificazione avviene interamente nel complesso di Golgi ^33,34. Ci sono diverse strutture di – glycan Oche possono essere costituiti da N– acetilglucosamina, fucosio, galattosio e acido sialico con ogni monosaccaride aggiunto in sequenza ³³.

Mentre nessuna sequenza specifica è stata identificata come prerequisito per molti tipi di O– glicosilazione, una sequenza di consenso comune è stata associata con la N-collegato modifica: Asn-X-Ser/Thr/Cys, dove X può essere qualsiasi amminoacido tranne Pro ³³. STIM1 EFSAM contiene due di questi siti di consenso N– glicosilazione: Asn131-Trp132-Thr133 e Asn171-Thr172-Thr173. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che la EFSAM può essere N– glicosilata in cellule di mammifero in Asn131 e Asn171 ^38,39,40,41. Tuttavia, gli studi precedenti delle conseguenze di N– glicosilazione su SOCE sono state incongruenti, suggerendo soppresso, ha rafforzato o alcun effetto di questa modifica alberino-translational su SOCE attivazione ^38,= “xrif” > 39^,40,41. Così, la ricerca sulle conseguenze biofisiche, biochimiche e strutturali sottostanti di EFSAM N– glicosilazione è fondamentale per comprendere gli effetti normativi di questa modifica. A causa del requisito per alti livelli di proteine omogenei in questi esperimenti in vitro , è stato applicato un approccio selettivo sito cui connettersi covalentemente moiety glucosio EFSAM. Interessante, Asn131 e Asn171 glicosilazione causato cambiamenti strutturali che convergono all’interno del nucleo EFSAM e che permettono di migliorare le proprietà biofisiche che promuovono STIM1-mediata SOCE ⁴².

L’allegato chimica dei gruppi glicosilici Cys tioli è stata consolidata da un lavoro seminale che in primo luogo ha dimostrato l’utilità di questo enzima-libero approccio alla comprensione degli effetti specifici del sito di glicosilazione su proteina funzione ^{43 , 44}. più recentemente e per quanto riguarda STIM1, i residui Asn131 e Asn171 erano mutati di Cys e glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] è stato usato per covalenza collegarsi glucosio i tioli liberi ⁴². Qui, Descriviamo questo approccio che non solo utilizza mutagenesi per incorporare i residui di Cys specifici sito per la modifica, ma si applica anche la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) soluzione per valutare rapidamente strutturale ed efficienza di modifica perturbazioni a causa la glicosilazione. In particolare, questa metodologia generale è facilmente adattabile per studiare gli effetti di entrambi O– o N– glicosilazione di qualsiasi recombinantly prodotto della proteina.