استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

تخزين الكالسيوم تعمل (Ca^{2 +}) إدخال (سوسي) هو الطريق الرئيسية التي تأخذ الخلايا المناعية يصل Ca^{2 +} من الفضاء خارج الخلية إلى سيتوسول. في الخلايا اللمفية تي، ربط مستقبلات خلية تي يقع في غشاء البلازما (م) مولدات المضادات التي تنشيط بروتين تيروزين مؤنزم (استعرض في ^1،،من²³). سلسلة الفسفرة يؤدي إلى تنشيط phospholipase-γ (PLCγ) الذي يتوسط التحلل المائي لغشاء فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة₂) فيما بعد إلى دياسيلجليسيرول واينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي (IP₃ ). الملكية الفكرية₃ هو رسول ديفوسيبلي صغيرة التي تلزم للملكية الفكرية₃ مستقبلات (IP₃R) في هيولى (ER) مما فتح هذه القناة مستقبلات وسمحت Ca^{2 +} تدفق أسفل التدرج تركيز لائحة التجويف إلى سيتوسول (استعرض في ⁴). مستقبلات الإشارات من البروتين ز إلى جانب وتيروزين كيناز مستقبلات في مجموعة متنوعة من الرصاص أنواع منفعل وغير منفعل خلية أخرى لإنتاج نفس IP₃ والتنشيط للملكية الفكرية₃روبية.

سبب المحدودة Ca^{2 +} السعة التخزينية للائحة، الملكية الفكرية₃-الإفراج عن الوساطة والزيادة الناتجة في كاليفورنيا سيتوسوليك^{2 +} فقط عابر؛ ومع ذلك، آثار هذا استنفاد ER لومينال Ca^{2 +} عميقا نوع التفاعل stromal جزيء-1 (STIM1)،–أنا ترانسميمبراني (TM) العثور على البروتين معظمها على غشاء ER ^5،،من⁶⁷. STIM1 يحتوي على المنحى التجويف Ca^{2 +} الاستشعار عن مجال تتكون من زوج EF-اليد والعقيمة α-عزر (أفسام). يتم فصل ثلاثة مجالات لفائف ملفوف المنحى سيتوسوليك من أفسام بالمجال TM واحد (في ⁸استعراض). عند ER Ca^{2 +} نضوب لومينال، يخضع أفسام^{9 7،}أوليجوميريزاتيون إلى جانب زعزعة الاستقرار التي تسبب ترتيبات هيكلية جديدة من الخرائط المواضيعية والمجالات لفائف ملفوف ¹⁰. تتوج هذه التغييرات الهيكلية في تعويض STIM1 في ER-م تقاطعات ^11،12،،من¹³¹⁴ من خلال التفاعلات مع فوسفوينوسيتيديس الساعة ^{15، 16} و Orai1 مفارز ^17،18. Orai1 البروتينات هي مفارز م فيها تجميع للنموذج Ca^{2 +} قنوات ^19،20،،من²¹²². تسهيل التفاعلات STIM1-Orai1 في تقاطعات ER-م فتح Ca^{2 +} الإفراج عن تنشيط Ca^{2 +} (قلعة) قناة المطابقة التي تمكن الحركة من Ca^{2 +} في سيتوسول من تركيزات عالية الفضاء خارج الخلية. في الخلايا المناعية، حمل سيتوسوليك المطرد Ca^{2 +} المرتفعات عبر قنوات قلعة Ca^{2 +}-كالمودولين/calcineurin تعتمد ديفوسفوريليشن للعامل النووي من خلايا تي المنشط الذي يدخل بعد ذلك النواة و يبدأ تنظيم النسخي الجينات تعزيز تي خلية التنشيط ^1،3. ما يسمى عملية التنشيط قناة قلعة STIM1 ^23،24 عن طريق فعل مؤثر ER لومينال Ca^{2 +} نضوب والناتجة عن المطرد سيتوسوليك Ca^{2 +} الارتفاع جماعي سوسي ²⁵. يتضح الدور الحيوي الذي تؤديه سوسي في خلايا تي بدراسات تثبت أن الطفرات الموروثة في كل من STIM1 و Orai1 يمكن أن تسبب نقص المناعة المشتركة الشديد المتلازمات ^3،،من^{1926، 27}-يبدأ أفسام سوسي بعد الاستشعار ER لومينال Ca^{2 +} استنفاد عبر فقدان Ca^{2 +} التنسيق على يد EF الكنسي، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رابطة الذاتي إلى جانب زعزعة الاستقرار ^{7، 28،29}.

جليكوسيلاتيون هو مرفق التساهمية وتجهيز الهياكل oligosaccharide، ويعرف أيضا باسم جليكانس، من خلال مختلف الخطوات السكروز في ER وغولجي (استعرض في ^30،،من³²³³). هناك نوعين الغالب من جليكوسيلاتيون في حقيقيات النوى: N-مرتبط و يا-مرتبطة، اعتماداً على الأحماض الأمينية المحددة وذرة سد الربط. ترفق أميد سلسلة جانبية من Asn في N-جليكوسيليشن، جليكانس، وفي معظم الحالات، يحدث خطوة البدء لائحة ببتيد سلسلة التحركات في التجويف ³⁴. وتتمثل الخطوة الأولى من N-جليكوسيليشن نقل بنية أساسية أربعة عشر-السكر تتكون من الجلوكوز (الأخضر)، ويطلق (رجل) و نون-أسيتيلجلوكوساميني (جلكناك) (أي الأخضر₃رجل₉جلكناك₂) من ER غشاء الدهن ^35،أوليجوساكتشاريلترانسفيراسي³⁶. مزيد من الخطوات، مثل الانقسام أو نقل مخلفات السكر، التي تحفزها لائحة محددة جليكوسيداسيس وجليكوسيلترانسفيراسيس. يمكن أن تكون بعض البروتينات التي تترك لائحة وأن تنتقل غولجي كذلك المجهزة ³⁷. س-جليكوسيلاتيون يشير إلى إضافة جليكانس، عادة إلى مجموعة الهيدروكسيل سلسلة الجانب بقايا سر أو منتدى المجالس الرومانسية، ويحدث هذا التعديل تماما في ^33،مجمع غولجي³⁴. وهناك العديد من الهياكل-جليكان سالتي يمكن أن تتكون من N-أسيتيلجلوكوساميني، فوكوسي، واللبن، وإضافة حمض اللعابي مع كل أحادي التسلسل ³³.

في حين تم التعرف على لا تسلسل معين كشرط أساسي لأنواع عديدة من س-جليكوسيلاتيون، ارتبط تسلسل آراء مشتركة N-يرتبط التعديل: Asn-X-Ser/الثريونين/Cys، حيث X يمكن أن يكون أي من الأحماض الأمينية ما عدا المحترفين ³³. أفسام STIM1 يحتوي على اثنين من هذه المواقع-glycosylation توافق N: Asn131-Trp132-Thr133 و Asn171-Thr172-Thr173. وفي الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن أفسام ن-الغليكوزيلاتي في خلايا الثدييات في Asn131 و Asn171 ^38،39،،من⁴⁰⁴¹. بيد أن الدراسات السابقة المترتبة على N-جليكوسيليشن على سوسي كانت تتعارض، مما يوحي بقمعها، بوتينتياتيد أو أي تأثير من هذا التعديل بوستترانسلاشونال في^، سوسي التنشيط ³⁸= “xref” >^40،،39⁴¹. وهكذا، البحوث المتعلقة بآثار أفسام N-جليكوسيليشن الفيزيائية-الحيوية والكيمياء الحيوية والهيكلية الكامنة وراء أمر حيوي لفهم الآثار التنظيمية لهذا التعديل. بسبب الحاجة إلى مستويات عالية من البروتينات متجانسة في هذه التجارب في المختبر ، تم تطبيق نهج موقع انتقائي لإرفاق الجلوكوز مويتيس أفسام تساهمي. من المثير للاهتمام، جليكوسيليشن Asn131 و Asn171 بسبب التغييرات الهيكلية التي تتقارب داخل نواة أفسام وتحسين الخصائص الفيزيائية-الحيوية التي تنهض بوساطة STIM1 سوسي ⁴².

ملحق الكيميائية من جماعات glycosyl ثيولس Cys كانت راسخة بعمل المنوي التي أثبتت فائدة هذا النهج خال من إنزيم لفهم آثار خاصة بالموقع جليكوسيلاتيون على وظيفة البروتين ⁴³ أولاً ^{, 44}-في الآونة الأخيرة، وفيما يتعلق STIM1، كانت تحور بقايا Asn131 و Asn171 إلى Cys و glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] وكان يستخدم لربط تساهمي الجلوكوز ثيولس الحرة ⁴². وهنا، يمكننا وصف هذا النهج الذي لا يستخدم الطفرات لإدراج موقع بقايا Cys محددة لتعديل فحسب، بل ينطبق أيضا على حل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) لسرعة تقييم كفاءة التعديل والهيكلية الاضطرابات نتيجة جليكوسيليشن. جدير بالذكر أن هذه المنهجية العامة يمكن تكييفها بسهولة دراسة آثار أما O-أو N-جليكوسيليشن أي ريكومبينانتلي إنتاج البروتين.