Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Opslaan van bediende calcium (Ca^{2 +}) post (SOCE) is de grote pad waarop immuuncellen Ca^{2 +} van de extracellulaire ruimte in het cytosol duren. In T lymfocyten binding T-cel-receptoren gelegen op het plasma-membraan (PM) antigenen die eiwit tyrosine kinases activeren (herzien in ^1,2,3). Een cascade van fosforylering leidt tot de activering van fosfolipase-γ (PLCγ) die vervolgens doorgeeft van de hydrolyse van membraan phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP₂) in diacylglycerol en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-₃ ). IP-₃ is een kleine diffusible boodschapper dat aan IP-₃ receptoren (IP-₃R) op het endoplasmatisch reticulum (ER) waardoor deze receptor-kanaal opent en toelaat Ca^{2 + bindt} aan de gradiënt van de concentratie van de ER stromen lumen naar het cytosol (herzien in ⁴). Receptor signalering van G-eiwit gekoppelde en tyrosine kinase receptoren in een verscheidenheid van andere prikkelbaar en niet-prikkelbaar cel typen lood op de dezelfde productie van IP-₃ en activering van IP-₃Rs.

Als gevolg van de eindige Ca^{2 +} opslagcapaciteit van de ER, de IP-₃-gemedieerde release en resulterende toename van cytosolische Ca^{2 +} is alleen voorbijgaande; echter deze uitputting van de ER luminal Ca^{2 +} diep gevolgen stromale interactie molecuul-1 (STIM1), een type-ik transmembraan (TM) eiwit meestal aangetroffen op de ER membraan ^5,6,7. STIM1 bevat een lumen-georiënteerde Ca^{2 +} sensing domein bestaat uit een paar van de EF-hand en steriele α-motief (EFSAM). Drie cytosolische georiënteerde spiraalsnoer-spoel domeinen zijn gescheiden van de EFSAM door de één TM domein (herzien in ⁸). Na ER luminal Ca^{2 +} uitputting ondergaat EFSAM een destabilisatie-coupled oligomerisatie ^7,9 waardoor structurele herschikkingen van de TM en spiraalsnoer-spoel domeinen ¹⁰. Deze structurele veranderingen uitmonden in een overlapping van STIM1 bij ER-PM kruispunten ^11,12,13,14 door middel van interacties met PM-phosphoinositides ^{15, 16} en Orai1 subeenheden ^17,18. Orai1 eiwitten zijn de PM subeenheden die aan formulier Ca^{2 +} kanalen ^{19,20,21,22 monteren}. De STIM1-Orai1-interacties bij ER-PM kruisingen vergemakkelijken een open Ca^{2 +} versie geactiveerd Ca^{2 +} (CRAC) kanaal conformatie waarmee het verkeer van Ca^{2 +} in het cytosol door de hoge concentraties van de extracellulaire ruimte. In de immuun cellen, de aanhoudende cytosolische Ca^{2 +} waterstand via CRAC kanalen veroorzaken de Ca^{2 +}– Calmoduline/calcineurin afhankelijke defosforylerings van de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, die vervolgens de kern en begint transcriptionele verordening van genen bevordering van T-cel activatie ^1,3. Het proces van de CRAC kanaal activering door STIM1 ^23,24 via agonist-geïnduceerde ER luminal Ca^{2 +} uitputting en de resulterende aanhoudende cytosolische Ca^{2 +} elevatie wordt collectief SOCE ²⁵genoemd. De vitale rol van SOCE in T-cellen is duidelijk door de onderzoeken die aantonen dat erfelijke mutaties in zowel STIM1 als Orai1 leiden strenge gecombineerde immunodeficiency syndromen ^3,19,26, tot kunnen ²⁷. EFSAM start SOCE na sensing ER-luminal Ca^{2 +} uitputting via het verlies van Ca^{2 +} coördinatie op de canonieke EF-hand, dat uiteindelijk leidde tot de destabilisatie-coupled zelfstandige vereniging ^{7, 28,29}.

Glycosylatie is de covalente gehechtheid en de verwerking van oligosaccharide structuren, ook bekend als glycanen, door verschillende biosynthetic stappen in de ER en Golgi (herzien in^{3332, 30,}). Er zijn twee dominante soorten glycosylatie in eukaryoten: N-gekoppelde en O-gekoppeld, afhankelijk van de specifieke aminozuur en Atoom het overbruggen van de koppeling. N– glycosylation, glycanen zijn bevestigd aan de kant keten amide van Asn, en in de meeste gevallen de inleiding stap vindt plaats in de ER als de polypeptide keten pakt de lumen- ³⁴. De eerste stap van N– glycosylation is de overdracht van een veertien-suiker kern structuur bestaande uit glucose (Glc), mannose (Man) en N– acetylglucosamine (GlcNAc) (d.w.z. Glc₃Man₉GlcNAc₂) van een ER membraan lipide door een oligosaccharyltransferase ^35,36. Verdere stappen, zoals splitsing of overdracht van glucose residuen, zijn in de ER gekatalyseerd door specifieke glycosidases en glycosyltransferases. Sommige eiwitten die ER verlaten en verhuizen naar het Golgi kunnen verder verwerkte ³⁷te zijn. O– glycosylation verwijst naar de toevoeging van glycanen, meestal aan de kant keten hydroxylgroep van Ser of Thr residuen, en deze wijziging gebeurt volledig in het Golgi-complex ^33,34. Er zijn verschillende structuren van het O– glycan die kunnen worden samengesteld uit N– acetylglucosamine fucose, galactose en sialic zuur met elke monosaccharide toegevoegd sequentieel ³³.

Terwijl zonder specifieke volgorde is geïdentificeerd als voorwaarde voor vele soorten O– glycosylation, een gemeenschappelijke reeks van consensus is in verband gebracht met de N-wijziging gekoppeld: Asn-X-Ser/Thr/Cys, waarbij X een aminozuur kan zijn behalve Pro ³³. STIM1 EFSAM bevat twee van deze consensus N– glycosylation sites: Asn131-Trp132-Thr133 en Asn171-Thr172-Thr173. Inderdaad, vorige studies hebben aangetoond dat EFSAM N– geglycosyleerde bij zoogdiercellen op Asn131 en Asn171 ^38,39,40,41kan zijn. Eerdere studies van de gevolgen van de N– glycosylation op SOCE geweest elkaar echter suggereren onderdrukt, Potentiation of geen effect door deze posttranslationele wijziging op SOCE activering ^38,= “xref” > 39^,40,41. Onderzoek over de onderliggende biofysische, biochemische en structurele gevolgen van EFSAM N– glycosylation is dus van vitaal belang voor het begrijpen van de regelgevende gevolgen van deze wijziging. Als gevolg van de eis van hoge niveaus van homogene eiwitten in deze in vitro experimenten, werd een site-selectieve benadering hechten covalent glucose wordt aan EFSAM toegepast. Interessant, veroorzaakt Asn131 en Asn171 glycosylatie structurele veranderingen die convergeren in de kern van de EFSAM en de biofysische eigenschappen ter bevordering van STIM1-gemedieerde SOCE ⁴²te verbeteren.

De chemische bevestiging van glycosyl groepen aan Cys thiolen geweest gevestigde door een baanbrekende werk die eerst gedemonstreerd het nut van dit enzym-vrije benadering voor het begrip van de specifieke effecten van glycosylatie op eiwit functie ^{43 , 44}. meer recentelijk als ten aanzien van STIM1, de Asn131 en Asn171 residuen waren gemuteerd naar Cys en glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] werd gebruikt om covalent glucose te koppelen aan de gratis thiolen ⁴². Hier beschrijven we deze aanpak die niet alleen mutagenese gebruikt te nemen site specifieke Cys residuen voor wijziging, maar geldt ook oplossing nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie om te snel beoordelen van zowel de efficiëntie van de wijziging en de structurele verstoringen als gevolg van de glycosylatie. Met name deze algemene methodologie is gemakkelijk aan te passen aan het bestuderen van de effecten van beide O– of N– glycosylation van om het even welk recombinantly eiwit geproduceerd.